中华医学遗传学杂志2000年第17卷第3期

廖林川孟海英^△侯一平张思仲颜有仪苏智广李英碧吴瑾张霁

摘要目的优化并评估一种新的探索基因组单核苷酸多态(single nucleotide polymorphism,SNP)的温度调控高效液相色谱技术。方法从洗脱方式、洗脱温度、检测器流通池规格、适应片段大小、检测灵敏度等方面，探讨适合探索基因组SNP的温度调控高效液相色谱技术参数及实用价值。结果找到在普通高效液相色谱仪上检测SNP的具有普遍意义的色谱条件。dNTP、PCR引物峰与被检测PCR产物峰完全分离，纯合子和杂合子样本能有效区分。建立起在普通高效液相色谱仪上进行快速筛选突变型DNA的温度调控高效液相色谱法。结论温度调控高效液相色谱法是一种高效、灵敏、操作简便、对较大片段具有普遍适用意义的探索基因组SNP方法。

关键词：温度调控高效液相色谱法；变性高效液相色谱法；单核苷酸多态性

温度调控高效液相色谱法(temperature-modulated high-performance liquid chromatography, TmHPLC)，又称为变性高效液相色谱法(de-naturing high performance liquid chromatography,DHPLC)^［1］，它是一种新的高通量筛选DNA序列多态性的技术。这一技术最先由美国Stanford大学Oefner及Underhill等^［2］于1995年报道，其原理是用离子对反向高效液相色谱法分离并检测异源双链。该方法具有半自动化、快速、检出率高、适合大片段等优点^［3，4］。Jin及Underhill等^［5，6］将其用于基因序列的比较、人类基因多态性的系统研究，已有采用该原理的专利化仪器， 称为WAVE DNA片段分析系统。目前已有多个实验室开始采用WAVE系统进行DNA突变的检测及疾病相关性研究^［7-9］。我们注意到高效液相色谱仪是已经在广泛使用的仪器，如果能够在普通高效液相色谱仪上进行单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)分析，无疑可以为SNP分析提供一种具有推广意义的技术选择。因此，我们通过实验系统地研究了各种技术条件，用普通的高效液相色谱仪和分析柱建立了具有普遍适用意义的、优化的SNP检测方法。

1材料和方法

1.1仪器高效液相色谱仪(美国惠普HP1100)；紫外可见分光光度计(日本岛津UV-260)。

1.2试剂TEAA(色谱纯，PE)，EDTA(色谱纯，Fluka),乙腈(色谱纯，Fisher),超纯水(电阻＞18 MΩ)，其它试剂均为色谱纯。

1.3样本100 bp为间距的DNA分子量标准物(Pharmacia)，及来源于人类基因组由PCR扩增所得的长度分别为148 bp、178 bp、269 bp、272 bp的DNA片段。

1.4聚合酶链反应

1.4.1DNA提取Chelex法提取DNA^［10］。

1.4.2聚合酶链反应我们设计的4对引物是针对Homo sapiens UWGC克隆和GGAT3G09克隆的5′agctcgcacgtccttagtgg和5′agccagcgtcacgttcaacg,5′atgtacattctgtgccacga和5′ggtcaagcaccaggtcgcgt，5′tgccgggaatgctataacatt和5′attgggttctttggaactgg,5′cccacactgggaccgcggtt和5′ccaattacggacgttcagtg。每一反应体系含模板DNA2～40 ng,1×Taq缓冲液，1.5 mmol/L MgCl₂，150 μmol/L dNTP,2 U Taq DNA聚合酶(Gibco/BRL),每种引物0.25 μmol/L,反应体积50 μl。在热循环仪(Biometra)中94 ℃变性1 min,60 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min，循环32次。产物用聚丙酰胺凝胶水平电泳确证。

1.4.3PCR产物定量取30 μl PCR产物，稀释成3 ml。用单引物浓度为0.25 μmol/L的1对引物溶液为空白对照，检测3个PCR产物在波长260 nm处的吸收度值。

1.5DNA序列分析用PCR循环测序法和ABI377自动激光荧光测序仪进行DNA序列分析。

1.6温度调控高效液相色谱分析将制备好的样本在色谱仪上进样、检测、记录和分析。以已知杂合子样本和纯合子样本色谱峰的保留时间和对称性，以及色谱图的基线、柱效等作为指标，对如下色谱条件进行摸索、筛选。(1)固定相：惠普dsDNA不锈钢柱(75 mm×2.1 mmi.d.,3.5 μm，填料为表面涂布有机涂料的硅化物)；同样填料的短柱(12.5 mm×4.6 mmi.d.,10 μm)作保护柱。(2)流动相：A液是TEAA和EDTA混合液；B液为A液中加入乙腈，将A液和B液按不同比例混合进行梯度洗脱。(3)柱温、流速及紫外检测波长根据片段大小，先从室温逐渐升高，并参考http://www.insertion.stanford.edu/melt.html中查得的推荐温度，流速0.2～0.8 ml/min。流通池分别为13 μl、5 μl及1.7 μl的检测器，紫外检测波长：260 nm,254 nm，参比波长：360 nm；同时收集紫外全光谱数据。

2结果与讨论

2.1DNA序列测定PCR产物经测序确定存在有突变，以长度为178 bp的DNA片段为例，测序结果如图1。选取其中的杂合子和部分纯合子用于TmHPLC。

图1长度为178 bp等位DNA片段的测序结果A：变异型，第75位有1个A→G突变； B：野生型

fig 1 Sequences of two allelesOne of them includes a single nucleotide mutation;A:DNA sequence,which includes an‘A’to‘G’mutation;B:DNA sequence,which has no mutation

2.2流动相为寻找适合分离引物及PCR产物的流动相条件，先在不变温状态下用DNA分子量标准品对下列流动相逐一筛选：(1)A液：0.05 mol/L TEAA,0.1 mmol/L EDTA;B液：0.05 mol/L TEAA,0.1 mmol/L EDTA,25%乙腈。(2)A液：0.1 mol/L TEAA,0.1 mmol/L EDTA;B液：0.1 mol/L TEAA,0.1 mmol/L EDTA,25%乙腈。(3)A液：0.2 mol/L TEAA,0.1 mmol/L EDTA;B液：0.2 mol/L TEAA,0.1 mmol/L EDTA,25%乙腈。然后用推荐温度并结合其他条件逐一考察拟选的流动相对色谱峰的保留时间、对称性、基线、柱效和色谱图等各项指标的影响。结果表明，条件(2)的分离效果最好，基线平稳。

2.3洗脱梯度我们采用的流动相中B液含乙腈浓度不超过25%，且由低到高进行洗脱使水溶性的DNA样品不致沉积在柱头，而先被洗脱出来，再用含乙腈浓度较高的流动相及双倍流速使杂质尽量被洗出，为下一次进样做准备。由图2A、B和C可以看出，随着流动相B在洗脱液中所占比例的增加，DNA样品在分析柱上的保留时间逐渐缩短。DNA样品在分析柱上的保留时间越短，色谱峰的峰高及宽峰之比越大。流动相中TEAA的主要作用是与DNA分子形成离子对，使DNA分子呈电中型，吸附在经硅烷基化处理色谱柱上。流动相中的乙腈是作为洗脱溶剂，将TEAA和DNA分子复合体从色谱柱上洗脱。

图2流动相中B液所占比例对分子量分型标准物中DNA片段洗脱保留时间的影响B液比例：A＞B＞C

fig 2 The effect on retention time of fragment eluted by mobile B in differential ratioThe ratio of B in mobile:A＞B＞C

2.4洗脱温度实验中发现随着柱温的提高，DNA分子的保留时间缩短。272 bp的DNA样品在不同温度条件下的检测结果如图3。61.5 ℃时，该样品的保留时间是5.08 min;63.5 ℃时保留时间是4.18 min;65.5 ℃时是3.53 min。

另一方面，使用Stanford大学软件推荐的温度检测一定数量的样本后，未能观察到野生型和突变型的杂合子时，难以判断是所测样本在该DNA片段上确实不存在序列多态，还是由于温度不当没有检测出。此时对温度在±2℃范围作适当调整，观察峰高与峰宽的比值是否发生改变，可以间接判断选择的洗脱温度是否合适。同时，也有助于观察到原温度条件下不能检测出的序列多态，可提高检出率。

图3不同温度对272 bp DNA片段洗脱保留时间的影响A:61.5 ℃；B：63.5 ℃；C：65.5 ℃；a:引物峰；A、B和C：DNA片段峰

fig 3 The effect on retention time of fragment in differential temperatureA：61.5 ℃；B：63.5 ℃；C：65.5 ℃;a:peak of primers;A,B and C:peaks of DNA fragments

2.5流通池对于SNP，野生型和突变型DNA分子序列只相差一个核苷酸，构象极相似，在DHPLC检测时，依靠构象不同分离，需要有极高的检测效能。我们先后用过13 μl、5 μl和1.7 μl流通池，在相同温度和梯度条件下，13 μl流通池检测出的DNA样品峰高宽比最小，分离度最小。1.7 μl流通池检测出的DNA样品峰高宽比最大，分离度最高。说明选用大流通池时，虽然光路较长，检测灵敏度较高，但由于已分离的样品各组分在流通池内再混合，使分离度降低，SNP纯合子和杂合子无法区别(图4)。因此保证有足够灵敏度时，应选择最小的流通池(1.7 μl)。

2.6灵敏度3个PCR产物经紫外分光光度计检测吸收度值分别为0.039、0.043和0.030，平均吸收度值为0.037。根据吸收度值为1约相当于50 μg/ml的经验公式，本次实验的平均PCR产物浓度为185 μg/ml。取0.5～10 μl PCR产物进柱，Tm