中华医学遗传学杂志2000年第17卷第3期

杨春邱长春卢圣栋涔维浚卓玛崔超英才旦朱席琳刘怡雯周文郁庄兰平仁丹

摘要目的寻找血管紧张素原(angiotensinogen, AGT)基因核心启动子区域存在的突变，分析该突变在中国西藏人群中的分布以及与原发性高血压的关联。方法以藏族103例原发性高血压患者和82名健康受试者为研究对象进行病例-对照研究。用聚合酶链反应-单链构象多态性(polymerase chain reaction/single strand conformation polymorphism, PCR/SSCP)分析和自动荧光测序方法，对AGT基因核心启动子区域DNA序列进行突变分析；用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction/restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP)方法分析AGT基因(-6)位点多态性。结果PCR/SSCP分析发现，AGT基因转录起始位点上游(-20)位存在A→C突变，统计分析显示，藏族正常人群与高血压人群中该位点A等位基因均有较高的发生频率(0.9175，0.9124)，突变位点多态性分布无统计学差异(P＞0.8)。AGT基因转录起始位点上游(-6)位点存在A→G突变，在藏族正常人群中等位基因A和G分布频率分别为0.780和0.220，原发性高血压群体中它们的分布频率分别为0.626和0.374，两者之间存在差异(P＜0.025)。结论(1)藏族群体中AGT基因(-20)A等位基因有较高的分布频率；(2)AGT基因(-6)G等位基因在藏族高血压患者群体中发生频率较高，可能是藏族原发性高血压的遗传易感因子。

关键词：血管紧张素原基因；核心启动子；原发性高血压；藏族人；聚合酶链反应-单链构象多态性；聚合酶链反应-限制性片段长度多态性

血管紧张素原(angiotensinogen, AGT)是肾素-血管紧张素系统的唯一初始底物，AGT基因是原发性高血压的候选易感基因。近年来的分子流行病学调查表明，AGT基因上的某些突变可能是血压升高的危险因子^［1］，并且这些突变在不同人群中的分布以及对血压调控的影响程度不尽相同。目前，群体调查和体外转染实验中，对AGT基因多态与高血压相关性研究都主要集中在其启动子区域和235、174编码子位上^［1，2］。AGT基因核心启动子区域位于TATA框与转录起始位点之间，对AGT基因转录表达起重要调控作用^［3］。目前已发现AGT基因核心启动子区域上一个顺式作用元件AGCE1，可以与转录因子AGCF1结合，通过与上游ALE序列和下游3′增强子元件相互作用，影响AGT基因转录^［4］。体外实验表明，AGCE上(-6)位点G→A的突变可以直接影响AGT基因基础转录速率^［5］。有研究认为(-6)A等位基因可能是原发性高血压的易感因素^［2］。目前西藏拉萨藏族人群中高血压的发病率已高达17.7%。藏族人长期生活在青藏高原，生活环境较为特殊(高寒，缺氧)，遗传背景和生活方式较为一致，是研究遗传相关疾病的理想材料。我们通过对藏族人群血管紧张素原基因核心启动子区域的突变分析，研究藏族人群中AGT基因与血压的关系，探讨藏族群体中原发性高血压的可能发病机理。

1对象与方法

1.1对象均为拉萨地区藏族人。高血压患者的诊断按照WHO标准：收缩压≥130 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，舒张压≥90 mmHg，发病年龄低于60岁，有高血压家族史，即双亲至少一方和至少有1个同胞患有高血压病。排除继发性高血压、过度饮酒、服避孕药、糖尿病和肝、肾病史者。正常对照组中无高血压治疗史，无高血压家族史，排除肝、肾、甲状腺、糖尿病病史。两个组中年龄、性别匹配。无异族通婚。

1.2方法

1.2.1实验材料人基因组DNA样品取自实验对象外周血。低渗破裂红细胞，按标准方法提取白细胞基因组DNA。PCR扩增引物序列为：p1上游引物：5′-AGAGGTCCCAGCGTGAGTGT；p2下游引物：5′-AGACCAGAAGGAGCTGAGG；p3上游引物：5′-ACATTTGCACTTTGTACAGCA；p4测序引物：5′-AAGACTCTCCCCTGCCCTC。PCR扩增用引物、TaqDNA多聚酶及dNTP购自上海Sangon公司；酶切分析用限制性内切酶购自中国协和医科大学科技开发公司；其它试剂均为国产分析纯试剂。纯化PCR产物所用玻璃奶(二氧化硅溶液)由本实验室制备。

1.2.2目的片段的PCR扩增以实验对象基因组DNA为模板，用p1、p2引物对进行PCR片段1扩增。经SSCP电泳分析，选择有差异带型的样品，用p3、p2引物对进行PCR片段2扩增。PCR反应体系含有：模板DNA 100 ng，1×反应缓冲液pH 8.0,1.5 mmol/L MgCl₂，各5 pmol引物，各10 nmol dNTP，2 U Taq DNA多聚酶，反应总体积为50 μl。反应条件均为：94 ℃预变性5 min后，进行如下循环反应：94 ℃ 45 s，60 ℃ 25 s(片段2为45 s)，72 ℃ 30 s(片段2为60 s)，共35个循环；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

1.2.3PCR扩增产物的回收及纯化将扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，在长波紫外灯下用洁净手术刀片切割相应条带，用自制的玻璃奶回收凝胶中的DNA片段。

1.2.4PCR扩增片段1的SSCP分析取适量纯化的PCR扩增片段1，加入2倍体积变性缓冲液(98%甲酰胺，10 mmol/L NaOH,20 mmol/L EDTA,0.1%溴酚蓝，0.1%二甲苯青)，95 ℃变性5 min迅速置于冰上，3～5 min后上样于4 ℃预电泳15 min的10%非变性聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺为49∶1)。4 ℃、200 V电泳4 h，银染观察结果。

1.2.5PCR扩增片段1的RFLP分析取适量纯化的PCR扩增片段1，加适量限制性内切酶BstN Ⅰ，及相应的反应缓冲液，37℃温育3～4 h后，聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染检测酶切结果。

1.2.6PCR扩增片段2的PCR产物直接测序取纯化的PCR扩增片段2为模板，利用测序引物在ABI377自动测序仪上进行荧光测序。测序片段起始于PCR扩增片段2上5′下游约250 bp。

1.2.7统计分析采用χ²检验西藏正常人群和原发性高血压患者人群之间的差异，P＜0.05为有差异。

2结果

2.1PCR扩增结果PCR扩增片段1为233 bp；PCR扩增片段2为773 bp，其中3′端233 bp完全同于PCR扩增片段1，测序引物位于PCR扩增片段2的285～304位，距PCR扩增片段1约250 bp。测序片段约为500 bp，3′端包括完整的PCR扩增片段1。

2.2SSCP电泳带型及测序结果183个样品经SSCP电泳发现两种稳定出现的带型(图1)，带型A和带型B。测序结果表明带型A在AGT基因转录起始位点上游(-20)位为AA纯合，而带型B在此位点为AC杂合。

2.3RFLP酶切PAGE电泳带型及测序结果185个样品经RFLP电泳发现3种带型(图2)，带型A(103 bp,130 bp)代表AGT基因转录起始位点上游(-6)位纯合GG基因型；带型B(103 bp，75 bp,55 bp)代表AGT基因转录起始位点上游(-6)位纯合AA基因型；带型C(130 bp,103 bp，75 bp,55 bp)代表AGT基因转录起始位点上游(-6)位杂合AG基因型。PCR直接测序结果进一步验证了此结果。

图1PCR/SSCP电泳结果A：(-20)AA；B：(-20)AC

fig 1 Silver-staining result of PCR/SSCP band pattern in the core promoter region of AGT geneA：(-20)AA；B：(-20)AC

图2PCR/RFLP电泳结果Marker:PBR322/MspⅠ；A：(-6)GG；B：(-6)AA；C：(-6)AG

fig 2 Silver-staining result of PCR/RFLP in the (-6) site of AGT geneM：PBR322/Msp Ⅰ; A:(-6)GG;B:(-6)AA; C:(-6)AG

2.4西藏群体高血压相关性分析统计分析表明，实验样本基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。采用χ²统计，对群体来源的82名藏族正常样品和103例高血压样品AGT基因A(-20)C及A(-6)G多态性进行分析(表1，2)，发现携带AGT基因(-20)位点AA、AC、CC基因型的样品数目分别为66、14、0(其中2个样品未电泳)和86、17、0；A、C等位基因频率分别为91.75%、8.25%和91.24%、8.76%，两者之间不存在差异。携带AGT基因(-6)位点AA、AG、GG基因型的样品数目分别为47、34、1和41、47、15，基因型分布差异有显著性意义，χ²=12.84，P＜0.005。A、G等位基因频率分别为78.0%、22.0%和62.6%、37.4%，两者之间的差异有统计学意义，χ²=5.53,P＜0.025。

3讨论

3.1AGT基因(-20)A等位基因在西藏人群中出现极高的基因频率在本实验中，西藏正常对照组和高血压组中都出现较高频率的(-20)位点等位基因A(91.75%，91.24%)，并且两组之间不存在统计学差异，提示在西藏人群中高血压的形成与AGT基因(-20)位点突变无关。有报道AGT基因(-20)位为A等位基因时，此位点附近碱基序列组成雌激素受体结合位点(AGGTCANNNTGACCC)，(-20)位为C等位基因时，此位点附近是MLTF(一种对肝特异性调控起主要基础调控作用的因子)的结合位点(CTCGTCAC)，当(-20)位点发生A→C突变时，雌激素作用明显降低^［6］。西藏人群中高的A等位基因频率可能会影响AGT基因在雌激素诱导下的表达。日本人群的调查显示^［7］，人群中也存在较高的A等位基因发生频率(正常人为76.1%，高血压患者为80.2%)。

表1AGT基因(-20)位