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上海计划生育科学研究所（200032）
陈军玲 童传良综述 程利南审校
摘要进行性肌营养不良是一类发病率较高的性连锁隐性遗传病。由于患者不可治愈，防范此病的重点在于筛查携带者和对妊娠妇女进行产前诊断。发展多种技术针对营养不良（ dystrophin）基因不同突变类型进行检测及排除正常 x染色体遮蔽的干扰是女性携带诊断的关键，近年来随着分子生物学技术的发展，进行性肌营养不良症携带者的基因诊断方法和技术取得了一定的进展。
关键词：肌营养不良携带者检测基因诊断聚合酶链反应
进行性肌营养不良症（ duchenne muscular dystrophy/becker muscular dystrophy,DMD/BMD）是 x连锁隐性遗传病，临床表现为进行性加重的肌肉萎缩。新生男孩中的发病率约1/3500。依据临床表现不同，可将 dMD/BMD大致分为重型（ duchenne型）、中间型（ intemediate型）、和轻型（ becker型）[1]。目前根据临床症状和实验室检测对进行性肌营养不良症患者可作出明确诊断，但缺乏有效的治疗方法。检出女性携带者，对携带者妊娠时及时进行产前诊断以防止患儿出生是防范此病的重要措施。依据血清生化指标、肌电图、肌肉活检可对部分携带者作出初步诊断，但特异性不高，与正常人有一定程度的重叠，准确可靠的诊断应来自对肌营养不良（ dystrophin）基因分子水平的突变检测。近年来，随着脱氧核糖核酸（ dNA）重组技术的发展， dMD携带者诊断已从经典的 dNA印迹杂交转向以聚合酶链反应（ pCR）为基础的多种定性和定量研究，并从多个水平检测突变。本文仅就这方面的研究作一综述。
一、 dystrophin基因的突变机制
dystrophin基因定位于 xp21，是人类最大的基因，全长2.4Mb，占整个 x染色体长度的1%及整个基因组长度的0.1%[2]。大部分序列为内含子，平均大小为200bp的79个外显子长度仅为14kb。1987年 koening[3]完成了 dystrophin全长反向转录脱氧核糖核酸（ cDNA）的克隆，并得到其酶切图谱和亚克隆。 dystrophin基因编码含3685个氨基酸，分子量为427kda的蛋白，该蛋白位于肌细胞膜下，作为细胞的骨架蛋白，起支撑细胞的作用。 dystrophin基因突变时，其蛋白产物减少，细胞支撑功能降低，临床表现为肌肉萎缩和无力。
dystrophin基因突变的形式有多种，其中以缺失较常见，约占65%[4]，点突变，微小缺失或常规诊断方法检测不出的微小重复约占30%[5]，余5%来自重复[6]。发生缺失和重复的热点有两个： dystrophin基因的5′端和中央区，分别包括外显子3～19（30%）和外显子44～53（70%）[7]。98%缺失断裂点发生在内含子区域，其结果是引起断裂点范围内的外显子缺失。缺失片段大小不一，从一个外显子到几十个外显子，缺失片段的长短与疾病严重程度并不相关，但92%的患者基因检测结果表明缺失和重复是否导致阅读框架改变是造成临床表型不同的重要原因[8]。大部分 dMD和 bMD的小突变位于 dystrophin基因的非编码区，以错义突变产生终止密码子导致 dystrophin蛋白截短为常见。小突变在 dystrophin基因上的分布是随机的，不同于有突变热点的缺失和重复，但研究者一致认为， dystrophin基因的颈动脉搏动图（ cpG）序列区有较高的突变率[9]。
二、 dMD/BMD携带者的基因诊断
经家系分析可将 dMD/BMD女性携带者分为三种：肯定携带者（生过一个或一个以上患儿并有其他亲属患此病）；可疑携带者（生过一个或一个以上患儿但无其他亲属患此病）；可能携带者（母亲、姐妹或家系中其他女性亲属生过 dMD/BMD患儿）。以分子生物学手段进行携带者基因诊断可进一步确定基因突变类型，为遗传咨询和防止患儿出生提供依据。对基因突变位点直接检测以及运用基因内和基因旁侧与致病基因相连锁的多态标记进行单体型连锁分析是检测 dystrophin基因携带者的两种主要方法。当已知先证者的突变类型时，携带者检测则主要依靠各种分子生物学方法对突变位点进行检测；不能明确突变类型时，多态位点的限制性片段长度多态性（ rFLPs）连锁分析则是携带者检测和产前诊断的唯一方法。前者较为直接，结果更可信。
（一）突变类型已知的携带者诊断
1．缺失或重复型携带者
（1） dNA印迹杂交（ southern blot）分析 southern印迹杂交是检测缺失和重复突变的经典方法，常用探针有基因组 dNA和 cDNA探针。定量分析受检女性杂交带密度，当发生缺失或重复突变时，杂交带密度与正常女性相比为1∶2或3∶2。但这种定量方法受实验条件影响较大，对实验结果的评价因实验者经验限制带有一定的主观性。部分病人有异常连接片段 j带出现，其在杂交膜上的位置与正常条带不一致。脉冲场电泳（ pulsed field gelelectrophoresis,PFGE）是 j带检测较常用方法，特别是对大的 dNA片段，分辨率较高[7]，但 pFGE技术难度大，很难在一般实验室开展。 yamagishi[10]等改用单链电泳后的 southern印迹法分离 j带，不但降低了技术难度，而且使 j带的检测率从原来的17%提高到78%。 j带出现是缺失和重复型携带者检测的确切依据，遗憾的是，遗憾的是，伴有 j带型突变的病人不到5%，大大限制了该方法的使用价值。
（2）在 pCR Chanberlain[11]和 beggs[12]等分别设计了9对引物，通过 pCR扩增可检测到98%的缺失和重复突变。患者的 pCR扩增结果表现为条带的缺失。携带者因有正常 x染色体的掩盖， dystrophin基因缺失或重复不能通过扩增产物的电泳结果反映出来，必须对扩增产物进行定量分析。由于在一定的循环次数内 pCR产物呈对数增长， pCR产物的相对定量分析显示缺失型或重复型携带者相应基因产物为正常妇女的1/2或1.5倍。 pCR产物放射自显影测定、 eB染色和荧光分析是定量的主要方法。其中荧光定量分析可达到自动化，且对操作者无伤害，近年来有取代同位素和 eB染色定量法的趋势，在基因剂量分析中起着重要作用。
竞争性定量 pCR分析法检测缺失或重复型携带者的原理是用两对引物，在限量酶存在的情况下分别扩增已知缺失或重复的外显子和对照外显子，由于两对引物间的竞争，携带者相关外显子与对照外显子 pCR产物的电泳条带密度扫描比值约为1∶2或2∶3。竞争性 pCR定量法可检测以80%的缺失或重复型病例[13]。
短串联重复序列（ sTR）-PCR通过对风险女性在相关缺失位点的 sTR杂合性（ heterozygosity）或半合性（ hem izygosity）分析确定是否为携带者。所选 sTR位点必须与突变位点紧密连锁，风险女性在相关缺失位点的 sTR呈杂合态时，可基本排除携带者可能性，反之，携带者身份确立。由于 sTR-PCR原理仍基于连锁分析，基因内发生重组事件时，误诊可能性较大。为此， schwartz[14]同时分析分布于 dystrophin基因全长的 sTR（ sTR3′、 sTR45、 sTR49、 sTR5′）位点，结合荧光引物的多重 pCR，有助于发现基因内重组事件。同时，荧光分析可达自动化，避免了肉眼分析造成的误差。
依据 dystrophin基因“异位转录”[15]（ ecotopic transcription,即表达上有高度组织特异性的基因在其他类型的组织也有一定水平的表达，转录产物与特异组织相同）特性，可用逆转录技术（ rT-PCR）对血细胞中该基因的转录和逆转录进行研究。由于 dystrophin基因大部分断裂点位于内含子，因此转录的发生并不受到影响，缺失和重复只导致异常转录子的出现。携带者 rT-PCR表现为正常和异常大小转录片段同时存在。
（3）荧光原位杂交（ fISH） ried[16]最早将 fISH技术应用于 dystrophin基因携带者诊断，所用 dystrophin基因缺失区 cosmid探针含有大量重复序列，通过原位抑制杂交法可封闭探针上的重复序列，以减少非特异性杂交。最近， calvano[17]在此基础上改进为以患者单一序列，即缺失外显子为探针，直接检测携带者，同时选取 x染色体上与缺失部分相距较远的基因作对照。携带者显示单个荧光信号（对照位点为双信号）。单一序列探针与重复序列探针相比，特异性强，缺点是检出信号弱。以上 dystrophin基因携带者检测法仅限于已知患者缺失位点的情况下，当患者缺失位点不详时，制备含有 dystrophin基因可能突变区的 cosmid质粒或 yAC克隆探针，用多色 fISH法可同时检测多个可能突变区的缺失情况[18]。该多色 fISH法不受家系资料不全的限制，但当各种探针在 x染色体上的分布相隔太近时，信号的分辨率可能受到影响。研究者认为，染色体的组蛋白被去除后， fISH信号的分辨率可达5 kb。 fISH较传统的基因剂量分析更简便，易行，结果更直观。
2．点突变型携带者
点突变包括同义突变、错义突变、无义突变及移码突变，检测方法有多种，如单链构象多态分析（ sSCP）、异源双链分析（ hA）、化学错配裂解法（ cMC）、蛋白截短检测（ pTT）和直接测序法。由于 dystrophin基因非常巨大，使得点突变筛检相当困难，工作量较大。
（1）单链构象多态分析 35%～100%的点突变可用单链构象多态分析法检测出来。提高电泳分辨率有助于提高单链构象多态检测阳性率。携带者在单链构象多态电泳胶上表现为正常外显子的两条单链和突变外显子的两条泳动变位单链[19]。
