国外医学遗传学分册1999年第22卷第2期

解放军第211医院（哈尔滨150080） 李克深编译

哈尔滨市第一医院（哈尔滨150010） 杨丙娟编译

提要 自身免疫增多内分泌病变—念珠菌病—外胚层营养不良（APECED）是唯一一个单基因背景且位于MHC外的自身免疫病。APECED病的生化缺陷目前还不清楚。芬兰和日本的二个研究小组几乎同时完成了APECED基因的定位克隆，认为AIRE基因突变是APECED的致病原因，他们的研究为探索自身免疫病的分子基础提供了工具。

关键词：自身免疫病；基因；突变

人类自身免疫疾病的分子背景目前我们了解得较少，虽然很多自身免疫疾病有遗传基础，但由于实际出现的疾病表现往往是基因与环境因素相互作用的复杂产物，所以这些疾病表现出典型的多因素特征，以至于要找到这些疾病的易感基因十分困难。以下，一种罕见的符合孟德尔遗传规律的单基因常染色体隐性遗传病为我们提供了一条探索人类自身免疫疾病分子基础的途径。自身免疫性多内分泌病变—念珠菌病—外胚层营养不良（APECED）是第一个位于主要组织相容性复合体（MHC）以外的自身免疫疾病。特点是①自身免疫性多种内分泌病变（包括甲状旁腺功能减退，肾上腺皮质衰竭，IDDM，性腺衰竭，甲状腺功能减退，恶性贫血及肝炎）；②慢性粘膜与皮肤白色念珠菌病；③外胚层发育不良，而且一大部分病人会发生口腔粘膜鳞状细胞癌。此病在世界范围内均有报道，但在芬兰人（发生率1∶25000）和伊朗犹太人（发生率1∶9000）中发生率较高。

一、 APECED基因的定位克隆

芬兰和日本的研究小组于1997年12月同时报道了APECED基因的定位克隆。芬兰的研究小组首先通过连锁分析把APECED定位于染色体21q22.3，在D21S49和D21S171标记之间，而后通过连锁不平衡将其更精确地定位于D21S25和D21S171之间，然后他们构建了跨越此关键区的粘粒/P1/PAC/BAC重叠群。在APECED侯选区域内寻找候选基因的过程中，作者通过外显子捕获和cDNA筛选法克隆出了一个新基因C21orf3，其位于已知的PFKL基因的远侧，而后，经过SSCP分析排除了C21orf3和PFKL基因是APECED侯选基因的可能性。与此同时，作者在PFKL基因周围找到了一个新的多态标记，PB1，它位于PFKL基因第一个内含子内，且它在一个APECED家庭中专性重组，晕就把关键区域缩小至D21S25和PB1之间的145kb范围内。而后，通过基因查找软件Grail, xpound, Genie在PFKL的启动子上游预测出一个基因模型，在跨越预测的外显子G5和G6的区域内用PCR法扩增出一个316bp长基因组片段，并用此片段作探针筛先一个成人胸腺cDNA文库，得到了cDNA克隆B1-1，使用cDNA克隆B1-1作业探针进行的Northern印迹分析表明所有被分析的组织中均有一个大约2kb的转录产物，且在胸腺，胰和肾上腺皮质中转录产物较多。此cDNA序列GC含量较高，达到了68.8%，并包含一个581个氨基酸的开放阅读框。起始密码子ATG位于121位核苷酸处，终止密码子位于1756位核苷酸处，预测的蛋白含有545个氨基酸残基。他们将其命名为AIRE。日本的研究小组的克隆过程与上面的过程相近，他们先将APECED位点定位于D21S1912和D21S171之间500kb的范围内，然后建立粘粒/BAC重叠群。在D21S1912和PFKL间约140kb的范围内使用基因查找软件GRAIL和GESCAN找出一个基因AIRE，其位于PFKL基因附近，包含以前捕获的外显子HC21Exc33和MDL04M06。根据预测出的外显子序列他们合成了一套PCR引物，使用这些引物对不同的cDNA文库进行PCR筛选，最终在一个胸腺cDNA文库中分离出包含外显子HC21Exc33和MDL04M06的一个cDNA片段。此片段长2027bp，包含一个1635bp的开入阅读框，预测编码蛋白含有545个氨基酸残基。他们将其命名为AIRE-1。他们同时发现AIRE基因可以有三种不同剪接方式，另二种剪接产物编码蛋白AIRE-2（348个氨基酸残基）和AIRE-3（254个氨基酸残基）。

二、AIRE基因的基因组结构

AIRE基因包含了14个外显子，跨越大约11.9kb的基因组DNA。在外显子1的第一个核苷酸的上游35个核苷酸处，存在一个含有TATA框的推定的启动子。紧挨第一个外显子我们发现了一个GC框。在AIRE基因第一个外显子上游22kb范围内未发现有其它的外显子。此基因3＇端的分析表显外显子14就是AIRE的最后一个外显子。外显子14内的终止密码子位于1756位核苷酸处，其后是重复序列。此基因位于富含GC区域内，内含子一外显子边界符合GT-AG规则。

三、AIRE蛋白结构和特点

预测AIRE基因编码的蛋白包含545个氨基酸残基，理论分子量为57.7kD，计算的pI值为7.53。电荷分布分析表明未发现明显的电荷簇或周期性分布。作者预测APECED蛋白的二级结构主要由卷曲构成，出现α-蚴旋或β-折叠的可能性很小。这与蛋白质内含有大量的脯氨酸一致。进一步的分析表明，此蛋白内含2个由42个氨基酸残基构成的半胱氨酸富集区，每个都含有与PHD锌指相似的Cys4-His-Cys3型指结构。APECED中发现的此结构具体为：C₂₉₉，₄₃₄-XX-C₃₀₂，₄₃₇-X（8）-C₃₁₁，4₄₆-XX-C₃₁₄，₄₄₉-X（4）-H₃₁₉，₄₅₄-XX-C₃₂₂，₄₅₇-X（14）-C₃₃₇，₄₇₁-XX-C₃₄₀，₄₇₄（X代表任何氨基酸，括号内的数字代表间隔肽序列的长度）。AIRE的锌指基序与Mi-2,TIF1,Sp140等核蛋白中的PHD型锌指基序有很强的同源性。此外AIRE蛋白还含3个LXXLL基序，此种基序与核受体的结合有关。

四、AIRE基因内的突变

为了筛选APECED病人中AIRE基因的突变，两个研究小组均用PCR法扩增了所有14个外显子。PCR产物先用SSCP法进行分析，出现变异的样口再进行测序分析。日本的研究小组发现了二处突变，一处位于外显子6中889位核苷酸处出现的C→T转换，将精氨酸密码子（CGA）变成一个终止密码子（TGA），称之为R257X突变。此种突变在芬兰的APECED病人中最常见。另一处是位于外显子2中发现的一处错义突变，将83位氨基酸由赖氨酸（Lys）变为谷氨酸（Glu），作者称之为K83E突变。芬兰的研究小组除发现R257X突变外，还发现另外4种突变，分别为1086～1 089位点出现四核苷酸（CCTG）插入；1085～1 097位点出现13bp缺失；1284位点出现A的捼入；1313位点出现C的缺失。在正常对照人群中未发现这些突变以纯合的形式存在。R257X突变将Arg变为终止密码子，蛋白将只剩下256个氨基酸残基。而其它突变将导致移码，蛋白会被截至371至478个氨基酸残基。而且这些突变将导致至少一个PHD锌指的丢失。

五、讨论

APECED是唯一一个符合孟德尔遗传规律的人类系统性自身免疫疾病，也是唯一一个单基因的人类自身免疫疾病。AIRE基因的染色体定位和突变的发现说明它是APECED的致病基因。AIRE蛋白功能还不清楚，但有一点是清楚的，即PHD型锌指有与大分子（核酸或蛋白质）结合的特性。值得注意的是，在调节或介导转录的核蛋白中曾发出过此种基序，AIRE蛋白和Mi-2可能代表一类新的转录调控因子。虽然AIRE没有明显的核转移信号，但其它含有此信号的蛋白可能会与AIRE内含有的LXXLL基序与核受体的结合有关。所有已知的AIRE突变导致至少一个锌指的现象也支持上述观点，AIRE蛋白可能会因为锌指的丢失而丧失了与其它分子相互作用的功能。且前还不知道AIRE蛋白在APECED病人中的病理性免疫应答中起直接还是间接作用，在体外和动物模型内的AIRE蛋白功能分析将阐明此病的分子病理发生机制，AIRE基因及其蛋白将为人类自身免疫现象分子机制的阐明提供重要途径。

参考文献

1 Kentaro N et al.Nature genetics,1997;17:393

2 Johanna A et al.Nature genetics,1997;17:399

3 Ahonen P et al.N.Engl.J.Med,1990;322:1829

4 Bjores P et al.Am J Hum genet,1996;59:879

5 Altonen J et al.Genome res,1997;7:820

收稿)

校对：姬颖