国外医学儿科学发册1998年5月第25卷第3期

第一军医大学附属珠江医院儿科（510282） 江凌晓综述 封志纯审校

摘要 神经细胞的原代培养技术经过几十年发展已日趋成熟。在培养过程中神经细胞的存活、生长、发育、形态功能及衰老死亡受某些物质的影响，这与生理或病理条件下神经细胞的变化相似，因此可以通过对培养条件的控制来模拟神经的多种生理、病理变化，以期弄清多种疾病的发病机制，并为临床预防及治疗提供论依据。

关键词 神经生物学 细胞，培养的

神经细胞原代培养是一种应用广泛的实验室技术。它具有容易控制，对处理因素干扰小，实验结果稳定，观察指标易于选择和敏感的优点。因此，现已成为研究神经细胞形态和功能、生长和发育、损伤和再生及缺血等生理、病理变化及其影响因素的重要方法之一。

神经细胞的原代培养

一、取材 最早用于原代培养的神经细胞取自6－8天的鸡胚，以后大多取自15－18天胎龄的大鼠或小鼠^[1]，但实验动物的胎龄往往很难准确掌握，故近来多取自当天出生的大鼠。新生大鼠的神经细胞虽已近分裂后期，开始分化，但仍属幼年，对各种外界因素的适应性和可塑性仍比较强，故此种细胞的质量、数量和存活时间均能达到一般实验的要求。新生48小时的大鼠神经细胞由于分化的较完全，故其适应性和可塑性进一步降低，对照实验中可见细胞数量显著减少，培养16天后很难用于实验。

二、培养 取在冰箱（－12℃）冷冻10分钟左右的新生大鼠（出生24小时之内），在无菌条件下断头取脑置于盛有PBS液（Ph 7.2）的平皿中，在解剖显微镜下剥去脑膜，取大脑皮层（或其它区域如海马、隔区、纹状体、下丘脑等）并剪碎，在37℃下用0.125%胰蛋白酶液消化30分钟，中间振摇1－2次，消化后用吸管反复吹打（动作轻缓，避免产生气泡），制备细胞悬液。以1×10⁶个／ml细胞密度接种于涂有多聚赖氨酸的培养皿内，每皿2ml置于37℃，5％CO₂，饱和湿度的培养箱中进行培养（DMEM培养液含10％胎牛血清，100μg/ml谷氨酰胺，10mg/ml葡萄糖，100IU/ml青霉素，100μg/ml链霉素）。24小时后换培养液。培养第三天加入阿糖胞苷10^－5mol/L，以抑制非神经细胞的继续增长。

三、观察 正常情况下接种15小时后，大部分细胞贴壁，24小时后细胞伸出粗细不等的突起。随后胞体逐渐增大，突起伸长变粗，有的还发出分枝互相联络，交织成网，光晕明显且不断扩大。16天到24天为生长高潮，生长晕趋于稳定，细胞成熟。随后细胞数减少，空泡变性细胞开始出现，30天时间明显观察到突起减少缩短，光晕减弱，甚至细胞变性死亡。

某些物质对原代培养的神经细胞的影响

在原代培养过程中，多种物质如神经生长因子（NGF）、脑活素(cerebrolysin)、胶质细胞成熟因子（GMF）、一氧化氮（NO）、氨（NH₃）、细胞因子及多种金属离子（如Zn²⁺,Ca²⁺）等对神经细胞的存活、生长、发育、形态、功能及衰老死亡等有不同程度的影响。其影响程度与其对正常生理状态下的神经细胞的影响极其相似。因此，深入研究多种物质对原代培养的神经细胞的影响，将有助于弄清许多过去未能解释清楚的病理生理现象，并为神经系统病症的预防、治疗及探讨其发病机制提供新的思路和手段，具有重要的理论意义和应用价值。

一、NGF NGF是迄今为止研究最为广泛且深入的一种营养因子。以往人们认为CGF仅对周围神经系统的交感和感觉神经元起作用，而且作用产生于某一发育阶段。实际上NGF对中枢神经元，特别是中枢胆碱能神经元有明显的营养作用，能影响这些神经元的存活及生长分化，尤其是在培养早期给予NGF可增加其营养作用^[2-5]。如NGF可促进新生大鼠海马、皮质、小脑神经元的存活和轴突生长，刺激胶质细胞增生，促进新生大鼠隔区神经元的生长发育，使其细胞存活数显著增加，胞体迅速增大且生长得更加饱满，同时还能使神经元长出突起，并趋向共同培养的海马，即显著增加分布到海马组织的胆碱能纤维数量；同时还能提高乙酰胆碱酯酶（AChE）和胆碱乙酰转移酶（ChAT）的活性。体外实验还证实，NGF可促进神经细胞的分化、成熟，对轴索切断后神经细胞的死亡有明显的预防作用，且能促进损伤的轴索发生再生；另外，NGF还能通过诱发过氧化酶和谷胱甘肽转移酶的活性，调节神经细胞内氧化－抗氧化的平衡，保护神经元在老化期免受过氧化氢的损害。

由于NGF对神经细胞的发育、生长、损伤后再生起着极其重要的作用，故在神经系统疾病的预防和治疗上有很大的应用潜力。虽然NGF对新生的神经细胞有上述作用，但对成熟的神经细胞却主要表现为维持其正常生长而不表现其他作用，故临床上关于儿童与成年人在应用NGF治疗时，其适应症和疗效的报告多有不同，如对儿童，可用于治疗大脑发育不全引起的智力低下症。目前，临床上使用NGF治疗原发性癫痫、脑外伤、格林－巴利综合征等，均有一定效果。另外，由于Alzheimer综合征是因严重的神经元缺失（尤其是胆碱能神经元缺失）而引起的，故采用脑脊髓液内注射NGF的方法治疗Alzheimer综合征患者，其疗效令人鼓舞。

1. 脑活素 脑活素是一种易于通过血脑屏障的脑组织水解物，含85％的自由氨基酸和15％的低分子肽，具有良好的器官特异性。体外实验表明，脑活素具有营养神经细胞，促进其蛋白质合成并影响其呼吸链，改善脑神经细胞的代谢功能^[6-8]。但与NGF不同，脑活素缺乏支持存活和促突起生长的作用。大量临床实践表明，脑活素对情感、意识智能障碍和语言障碍的疗效更为明显，因此，在婴幼儿轻度大脑发育不全、脑瘫、注意力不集中、记忆力衰退等疾病的治疗中应用尤为广泛。
2. GMF GMF是一种酸性蛋白质，它不仅能刺激培养的成星形胶质细胞繁殖和分化，恢复Schwann细胞瘤和胶质细胞瘤的接触抑制，而且对中枢神经元具有神经营养作用。实验证明，纯化的GMF有促进原代培养的小脑皮层神经元生存的作用，且这种作用依赖于GMF的量（其最适浓度为250ng/ml）。同时还证明GMF有刺激双潜能胶质细胞增殖，导致生成大量少突胶质细胞及支持其生存的作用。但是少突胶质细胞的分化成熟起抑制或延缓其成熟的作用，即GMF对中枢神经元具有营养活性，且同时不能影响中枢大胶质细胞的发育和分化。GMF对中枢神经元的作用研究较少，其作用机制也不清楚，尚有待于进一步研究。其临床应用价值也有待于进一步开发。

四、NO NO是结构简单的小分子气体物质，含不成对电子，性质活泼，半衰期小于10秒，近年来被认为是一种新的细胞间和细胞内信息传递物质。它广泛地参与或调节体内的生理和病理活动，尤其是在中枢神经系统中，它既发挥信使传递功能，又介导谷氨酸（Glu）的神经毒作用。Glu 神经毒作用可引起多种神经退行性疾病的发生，如Alzheimer病、Huntington病等。

在正常情况下，神经细胞合成并释放出适量的NO，并不产生毒性作用。但有过量的Glu时，就会产生过多的NO，可以损伤周围的神经细胞。有研究发现，NO参与了Glu对原代培养的大脑层、纹状体和海马神经细胞的神经毒作用。同时Dawson等^[9]还在实验中发现，NO可产生剂量依赖的神经细胞损伤（以硝普钠作为NO的供给者）。即在低浓度时（神经细胞接触硝普钠的浓度小于50μM）细胞的存活、形态及生长与对照组无明显差别，但随着NO浓度增加，其细胞的形态发生明显变化：存活率下降，甚至出现聚积死亡。进一步研究还表明，在低浓度时，NO对体外培养的原代神经细胞的神经毒性作用与接触时间无依赖性。但在较高浓度时（神经细胞接触硝普钠的浓度大于125μM），接触时间的延长，神经细胞无论在形态还是在功能方面均出现了明显的变化，即产生了接触时间依赖的细胞损伤。这些都为Glu受体拮抗剂和一氧化氮合成酶抑制剂在临床的应用提供了重要依据。

五、NH₃ NH₃可引起神经元内Glu及天门冬氨酸下降，从而抑制神经元内苹果酸－天门冬氨酸穿梭作用，导致线粒体内一系列代谢障碍^[10]。因此NH₃可以引起原代培养的神经细胞肿胀，空泡变和颗粒变及坏死脱落。即NH₃对原代培养的神经细胞具有毒性作用。星形胶质细胞的形态改变是高血氨状态下中枢神经系统的主要病变，进一步研究又发现，神经元的病变程度与星形胶质细胞病变严重程度呈正相关，大多数形态正常的神经元分布在病变较轻的星形胶质细胞周围，即星形胶质细胞具有部分保护神经元的作用。Eddleston^[11]认为星形胶质细胞通过对NH₃的主动摄取，或细胞间的物质交换来缓解NH₃对神经细胞的毒性作用，是中枢神经系统中解NH₃毒的主要细胞，且成熟的星形胶质细胞因其更强的代谢NH₃的能力，而具有更强的保护作用。 这对于临床诊断具有重要意义。

另外，体外实验还表明，细胞因子如IL－1和IL－2可显著提高海马神经细胞的膜兴奋性；缺锌或锌过量时海马生长抑素神经元释放生长抑制素的能力均降低；人参总甙可明显提高运动神经元的活力，并同时抑制胶质细胞的活力；随着培养时间的延长，海马细胞突触体内游离Ca²⁺浓度会显著增高等等。这些都将有助于我们研究相关疾病的发病机制，并对儿童，成年人和老年人分别提出不同的可靠的预防及治疗措施。

参考文献

1. Taguchi T,Hucher M,Roa M,et al.Dev Bra