摘要 目的：应用荧光标记的mBNA差异显示技术。方法：提 取未经过／经过IFN、LPS处理的三组人单核细胞系U937的总RNA并以此为模板，采用荧光标 记的锚定引物，通过逆转录、差异显示PCR反应，经5．6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离差 异条带，回收后将其再扩增。结果：三组样本的 DD-PCR产物电泳显示长30 0 bp～2.0 kb不等的扩增片段，条带清晰、明亮，背景低，各样本相互间的差异不仅呈有 无的变化，亦表现出很多强弱改变；再扩增条带锐利、单一。结论：在本试 验室成功应用了荧光标记差异显示技术，可快速、敏感、经济有效地筛选各种未知的表达基 因。

中图分类号：Q781文献标识码： B

文章编号：1000-6834(200 0)04-0373-04

FLUORESCENT mRNA DIFFERENTIAL DISPLAY TECHNIQUE

WANG Gang-shi

（Department of Gastroenterology General Hospital of Chinese PLA , Beijing 100853;）

WANG Meng-wei

（Department of Gastroenterology General Hospital of Chinese PLA , Beijing 100853;）

YOU Wei-di

（Department of Gastroenterology General Hospital of Chinese PLA , Beijing 100853;）

WANG Hong-fan g

（ Institute of Zoology,Chinese Academy of Science, Beijing 100080）

FENG Mei-fu

（ Institute of Zoology,Chinese Academy of Science, Beijing 100080）

ABSTRACTAim: To apply fluorescent mRNA differential display technique.Met hods: Total RNA samples were extracted from human monocyte line U937 treat cd/untreated with IFN and LPS, and were used as templates in differential displa y PCR. The anchored primers used were labeled with the fluorescent tag. After ru nning on 5.6% denaturing PAGE gel, differentially expressed bands were excised a nd recovered, and finally reamplified. Results: Three tested samples all showed amplified bands differed from 300 bp to 2.0 kb, the bands were brigh t and clear, the background was low. Both yes/no changes and upregulated/downreg ulated happenings were shown simultaneously. The reamplification bands were shar p and pure. Conclusion: We have successfully practiced fluorescent differential display technique in our lab. It is a fast, safe and cost-effecti ve method used to sereen unknown expressed genes.

KEY WORDS:differential display;RNA;messenger ;fluorescence

mRNA差异显示技术(differential display，DD)是用于研究基因的差异表达的新方法。该技术自1992年^［1］]被首次报道后，即以其不可替代的优势被广泛应用于生物医学 领域。在应用过程中不断得到改进^［2］，并产生了诸多衍生技术如RPA(RNA finger printing by arbitrarily primed PCR)、GDD(genomic DD)等。本文简要介绍在本试验室荧 光标记差异显示技术(fluorescent DD，FDD)的应用及体会。

1材料与方法

1．1标本

人单核细胞系U937，细胞密度2×10⁸/L，分对照组(N)、处理Ⅰ组(T1)、处理Ⅱ组(T 2)，N用1640培养基及10％胎牛血清培养，T1用IFN-γ10⁴U/L LPS 1μg/L、T2用IFN- γ10 U/L LPS l0μg/L分别刺激7 h。

1．2主要试剂与仪器

TRIzol试剂(GIBCO BRL)、Fluoro DD试剂盒(Genomyx)、Supersript Ⅱ逆转录酶(GIBCO BRL)、AmpliTaq DNA聚合酶(GIBCO BRL)、RNase-free DNaseI(Promega);Genomyx LR 、 Genomyx SC、DNAThermal Cycler(Perkin Elmer)

1．3总RNA的制备

按试剂盒提供的方法分别提取三种细胞的总 RNA，以 RNase-free DNase I(终浓度80 000 U/L)除去其中污染的 DNA，经甲醛变性凝胶电冰鉴定其完整性，并以紫外分光光度计检 测其纯度

1．4mRNA差异显示

1.4．1逆转录反应选择锚定引物［T7(dT₁₂)AP(anchored prime rs，AP)，序列为5′ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTMN3′，其中 M＝A／G／C． N＝A /G/C/T］，以总RNA为模板进行逆转录反应，每管反应体系如下：总RNA l．0μg,AP 4 pmol ,70℃ 5 min,加入50 mmol/L Tris-HCl(pH8.3),75 mmol/L KCl,3 mmol/L MgCl₂,10mmol /L DTT,25μmol/L，dNTPmix(1∶1∶1∶1)，SuperScriptⅡ 60 Units，总反应体系20 μl 。42℃ 5 min，50℃ 50 min，70℃ 15 min。

1．4．2荧光标记差异显示PCR 选取与逆转录引物序列相同的带荧光物 质标记的锚定引物［TMR-T7(dT₁₂)AP］，随机引物(5'ACAATTTCACACAGGAACGCTAGTTG 3')，以逆转录产物为模板，进行PCR反应。反应体系包括：20 mmol/L Tris-HCl(pH8．4) ，50 mmol/L KCl，3．75 mmol/L MgCl₂，逆转录产物3．0 μl，50 μ mol/L dNTP mi x(1∶1∶1)，0．35 μmol/L 5'-随机引物,0．35 μmol/L 3-锚定引物,Ampli Taq 0.5 U nits，总反应体系10 μl。95℃ 2 min。94℃15 s，50℃ 30 s，72℃ 2 min，4个循环； 94℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 2 min，25个循环；72℃延伸7 min。

1．4．3分离差异显示片段配制5．6％变性聚丙烯酰胺凝胶，胶厚0．2 5 mm，大小61×33 cm。将PCR产物加4．0 μl上样缓冲液，95℃变性后上样。3000V、100 W 、55℃电泳4．5 h。干胶后置于Genomyx SC扫描，用系统所带的AcquireSC program软件分 析处理扫描结果。

1．4．4回收差异条带用AcquireSC软件将差异条带定位，用一次性手 术刀片切割下所需条带，置于30 μl去离子水中，37℃水浴30～60 min，备用。

1．4．5差异条带的再扩增以经上述处理的回收条带为模板，T7启动子 22-mer(5'GTAATACGACTCACTATAGGGC3')、反M13(-48)24-mer(5’AGCGGATAACAATTTCACACA GGA3')为引物,进行再扩增反应：模板2.0 μl,20 mmol/L Tris-HCl(pH8．4)，50 mmol/L KCl，1．5 mmol/L MgCl₂,20 μmol／L dNTP mix(1∶1∶1∶1)，0．2 μmol／L T7、0 ．2 μmol/L M13-r，AmpliTaq 1．0 U nits，总反应体系20 μl。反应条件同差异显示PC R。

2结果

2．1总RNA的质量

总RNA经Dnase I处理，用1．0％甲醛变性凝胶电泳，可见清楚的28 S、18 S、5 S条带 ，且28 S／18 S约为2∶1(图1)，表明RNA完整性好，无降解现象。N、T1、T2的OD260／OD28 0比值分别为1．92、1．83、1．98，表明样品纯度高。

Fig.1 Result of total RNA on formaldehyde-agarosegel

2．2荧光标记mRNA差异显示

结果显示每一泳道均有约50条大小不等的扩增产物，各组间比较见较多呈有无或强弱变 化的差异条带，图2中箭头所示。

Fig.2 Analysis of gene expression of c ells treated

with IFN and LPS by differential display technique

2．3差异条带再扩增

取T2中约1．25Kb的条带再扩增，结果见图3。

Fig.3 Reamplification result of differ entially expressed

band DNA marker is 200 bp ladder (200 bp～2 kb),1.0kb is arro wed

3讨论

基因表达是调节细胞生物学行为的核心。探讨处于不同生理、病理状态下的有机体之间 的未知表达基因的差异，是研究生命本质的有效途径。1992年报道的真核细胞mRNA差异显示 技术^［1］，为检测未知的表达基因提供了一种新的途径。DD技术具有快速、敏感、 可同时检测两组或以上的组织或细胞、RNA用量少、可检测某一表达基因的有无或其表达的 强弱等优点，一经问世即受到许多领域的重视并得以广泛应用。然而，该技术也存在着一些 缺陷，主要表现为：cDNA产物的质量较低，在序列胶中往往呈不清晰状态^［2］；所 得的cDNA片段通常小于500 nt，往往是3'-端的非翻译(编码)序列；所得差异片段的假阳性 高，可高达85%^［3］等。

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