摘要 目的和方法：采用双微电极电压钳(TEV)法研究细胞外Mn²⁺ 对非洲爪蟾卵母细胞表达的内向整流钾通道(IRK1)的阻断作用。结果：细 胞外Mn²⁺浓度分别为0、1.25、2.5、5、10和20mmol/L，K⁺浓度为90 mmol/L，可 见Mn²⁺对IRK1的瞬间电流(施加电压后2 ms)具有Mn²⁺浓度依赖性和电压依赖性 阻断作用；细胞外加Mn²⁺后反转电位没有变化，因而IRK1对之不通透。细胞外Mn ²⁺浓度较低时，抑制作用的效力比Mn²⁺浓度较高时强；细胞外K⁺浓度为90 mmol/ L和Ba²⁺浓度为30 μmol／L时，Mn²⁺可竞争性与Ba²⁺争夺结合位点，随 着Mn²⁺浓度增加，电流失活过程逐渐减缓，电场距离分数由0.45逐渐变小至0.28，Ba ²⁺在通道中的结合位点也逐渐离开通道，说明多离子通道IRKl中具有多离于阻断形式 ，同时也表明Mn²⁺与Ba²⁺。都是IRKl的一种快速开通道阻断剂。结论 ：细胞外Mn²⁺对IRK1的抑制作用通过了表面电荷机制和快速开通道阻断。

中图分类号：Q424文献标识码：A

文章编号： 1000-6843(2000)04-0331-04

THE BLOCKING EFFECTS OF EXTRACELLULAR Mn²⁺ ON THE

INWARD RECTIFIER POTASSIUM CHANNEL (IRKl)

XIE AnZANG Yi-min ZHU Miao-zhang

（Department of Physiology, Basic Science Institute, the Fourth Milita ry Medical University, Xi'an 710032）

ABSTRACTAim and Methods: Two-microelectrode voltage clamp (TEV) method was used to study the blocking effects of extracellular Mn²⁺ on the inward rectifier pota ssium channel (IRK1) expressed in the Xenopus oocytes. Results: Mn²⁺ can concentration-, time- and vol-tage dependently block IRK1 instan taneous currents (2 ms after voltage applied ). Mn²⁺ has almost no effect on the gating property of IRK1. IRK1 can not permeate Mn²⁺ because reverse potential did not changed. External Mn²⁺ can inhibit IRK1 macroscopic c urrents more powerfully when external Mn²⁺ concentration is lower and exte rnal Mn²⁺ can increases standard chord conductance of IRK1, Conclu sion: External Mn²⁺ works through surface potential mechanism. Ba ²⁺ is considered as one fast open channel blocker of IRK1 and three expone ntial fitting results indicates that external Mn²⁺ can compete with Ba ²⁺ in the same binding site in IRK1 when external Ba²⁺ concentration is 30 μmol/L. These mean two different mechanisms about external Mn²⁺ blocki ng exist.

KEY WORDS: manganese;inward rectifier potassium channel;voltage clamp;xenopus oocytes

探讨Mn²⁺对内向整流钾通道(IRK1)的阻断作用不仅在二价阳离子对IRK1阻断的分子机 制的研究中有重要意义，而且对于了解IRK1结构和功能有很大帮助。以往的研究由于技术水 平有限，对通道瞬间电流的分析不够准确(施加电压后10 ms)^［1］，采用的数据分析 方法也不够准确^［2］。已知Mn²⁺对IRK1的阻断作用主要表现在Mn²⁺可 以加快IRK1内向电流的失活过程，尤其在失活的开始部分。本文使用高质量电流曲线对Mn ²⁺的阻断作用做了较精确的评价，以期得出更准确的分析结论。

1材料与方法

1.1IRK1的表达

本文使用的IRKI的cDNA由L．Y.Jan博士(加里弗尼亚大学)馈赠。mRNA的线性化由XhoI 酶完成，转录过程使用mCAP^TMmRNA capping)试剂盒(Stratagene Inc,La，Jolla ，CA)，由T3多聚酶转录。mRNA的检测用凝胶电泳；其浓度测量用光谱仪，并于-80℃贮存。 使用第Ⅴ和Ⅵ期的非州爪蟾卵母细胞；在无钙的Barth液中使用胶原酶Ⅰ(SIGMA)处理1.5 h ，温度20℃，用纳升注射器(Drummond Scientific)将mRNA(1.85 ng／nl，30 ng)注入细胞 ；在正常带有抗菌素的Barth液中孵育24 h后使用。

1．2电流记录方法

全细胞电流记录使用双微电极电压钳(TEV)法，放大器为CA-1(Dagan Corp).用两个有3M KCI的微电极刺入细胞中，一个(尖端电阻0．2～0．3 MΩ)做为电流电极，另一个(尖端电 阻约0．5 MΩ)做为电压电极，两个电极尖端的形态特别重要，并且镀上Sylgard。感受电压 的电极置于细胞1 mm左右的距离。为了测量串联电阻，一个微电极置于细胞上前方约5 μm 处，串联电阻一般小于0．2 KΩ，在需要的时候使用串联电阻补偿。使用一接地的金属板置 于微电板之间以减少电容耦合干扰。另一个电流电极用于进行电容补偿，旋转三个时间常数 和三个相位延迟可以很好地进行电容补偿。漏电流在分析数据时再除去。

第一批实验对照浴液中含有(mmol/L)：KCl 90，HEPES5，MgCl₂3和Niflumic酸0. 2(用于阻断内源性Cl^-电流)，pH7.4。再将0、1.25、2.5、5、10和20 mmol/L的MnCl₂加 入对照浴液中。进行两个二价阳离子同时阻断的研究时，第二批实验对照液为(mmol/L)：KC l 90，HEPES5，BaCl₂ 0.03，EGTA 0.1和Niflumic酸0.2，pH7.4。使用氯化盐将游离的M n²⁺浓度加至1.25、2.5、5、10和20 mmol/L，pH调为7.4。游离的Mn²⁺和Ba 2+浓度的计算见文献^［3］。

换浴液时连续灌流速率约2．5～3.0 ml／min。接触电位用盐桥进行修正。电压波形由486计 算机与Digi Data 1 200(Axon lnstruments)产生。电流滤波频率为2 kHz，采样频率为10 k Hz，数据的获取由pCLAMP6(Axon lnstruments)完成。

实验温度为23～25℃。

1．3数据处理

数据分析采用pCLAMP6，Excel 97与Origin完成。阳离子剂量依赖性阻断数据用下式拟合：

I／I₀＝(I-U)｛1+［X］／K_d)｝+U (1)

其中I／I₀为阻断剂浓度为［X］时电流残留分数，K_d为平衡解离常数，U是在饱和的［ X］时电流不可阻断的分数。

对Mn²⁺阻断动力学分析是先采用三个指数函数的拟合

I＝A₁e^-(t-k)／τ1-A₂e^-(t-k)／τ2+A₃e^-(t-k)／τ3 (2)

其中τ为时间常数，最长的τ为阻断的时间常数，A为指数函数的权，K为进行拟合的起始时 间。然后进行下式拟合

1/τ＝1/τ(0)e^-δzFV/RT(3)

其中δ为电场距离分数，z为阻断剂的离子价，F，R和T为三个常用的热力学常数。

数据用均数±标准差(±s)表示，每组数据例数为3-4例。

2结果

2.1Mn²⁺对IRK1的阻断作用

Mn²⁺可加快IRK1的失活过程。这时反转电位没有变化，因而IRK1对Mn²⁺不 通透(图1A，B)。Mn²⁺对IRK1瞬间内向电流有Mn²⁺浓度依赖性阻断作用(图1C) ，细胞外Mn²⁺浓度越大，IRK1电流越小；细胞外Mn²⁺浓度较低时，抑制作用的 效力比Mn²⁺浓度较高时强(图1C)；这种阻断也同时具有电压依赖性，超极化越大，Kd 越小、，阻断越明显(图1D)。

Fig.1 Concentration dependent blocking effects of extrace

llular Mn²⁺ on the inward rectifier potassium

channel (IRK1) expressed in the Xenopus oocytes

A. Above: Macroscopic currents without extracellular Mn²⁺.

Down: IRK1 currents with 20 mmol/L Mn²⁺. Voltage duration is 500 ms ,

amplitude is from +40 mV to-150 mV step -10 mV. Holding potential is-30 mV.

B. Instantaneous I-V curve ( 2 ms after voltage applied ) . Data are from A.

C. Concentration dependent blocking effects of extracellular Mn²⁺ on IRK1 .

D. Vol