摘要 目的：探讨抗真菌药物对促性腺激素诱导的卵母细胞成熟的机理。方法：用小鼠卵母细胞体外培养模型，将小鼠卵母细胞培养在含有次黄嘌呤(HX ，卵母细胞成熟抑制物)的培养液中，观察促卵泡生成素(FSH)、两性霉素B、酮康唑对卵母 细胞减数分裂恢复的影响。结果：①FSH(10～200 IU/L)显著刺激卵丘-卵 母细胞复合体(CEO)克服HX的抑制而恢复减数分裂，该作用具有剂量依赖性(P＜0.05)； ②两性霉素B(0．0025～250 μg／L)也能够明显诱导CEO恢复减数分裂，其作用具有剂量依 赖性(P＜0.05)；③酮康唑(10^-7～10^-3 mol/L)剂量依赖性抑制FSH(50 IU ／L)诱导的卵母细胞减数分裂恢复(P＜0．05)，但并不影响卵母细胞的自发成熟(P ＞0．05)。结论：两性霉素B、酮康唑对卵母细胞减数分裂的恢复具有影响，其机理可能在于影响促性腺激素诱导的、卵丘细胞分泌的甾醇类物质(MAS)的产生。

中图分类号：Q492.5文献标识码：A

文章编号：1000-6834(2000)04-0358-03

THE REGULATING MECHANISM OF ANTI-FUNGICIDES

ON MOUSE OOCYTE DEVELOPMENT

LU Zhong-xian XIA Guo-liang WANG Hai-bin CHENG Yong LI Mei-ling

（College of Biological Sciences, China Agricultural University, B eijing 100094）

ABSTRACTAim: To study the mechanism of the effect of gonadotropin-induced o ocyte maturation.Methods:mouse oocytes were cultured in HX-medi um, and the effects of amphotericin B and ketoconazole on resumption of meiosis of mouse oocyte were examined. Results:① FSH(10～200 IU/L) indu ced a dose-dependent manner of oocytes maturation in CEO. A maximum increase in GVBD was observed with 25～50 IU/L FSH. ②Amphotericin tericim B (0.025～2.5 μ g/L)caused significant increases in GVBD in CEO, which mimicked the function of FSH.③Ketoconazole (10^-7～10^-3mol/L) inhibited the effect of FSH on resumption of meiosis, but no effect on oocyte spontaneous maturation. C onclution: Amphotericin B and ketoconazole are able to affect mouse oocy te maturation, and indicates that they have a regulation on FSH-induced synthes is of meiosis-activating sterol.

KEY WORDS: anti-fungicides;mechanism;mouse o ocyte development;MAS

两性霉素、酮康唑是很有效的抗真菌感染药物，应用很广。但临床应用及动物实验发现它有 一定的副作用，特别是对生殖功能具有一定影响。超量或长期使用，可导致男子血中睾酮浓 度降低、精子减少或缺乏、乳腺发育、女子月经失调等。但这些药物影响生殖的机理，由于 缺乏进一步的研究，一直知之甚少^［1］。最近一些研究发现，人卵泡液及牛睾丸组 织液中存在一种能诱导卵母细胞成熟的甾醇类物质(MAS)，可能作为一种阳性刺激因子，于 排卵前由促性腺激素诱导在卵泡中积聚，克服卵泡液中次黄嘌呤等物质的抑制，诱导卵母 细胞成熟^［2～6］。两性霉素、酮康唑结构近于甾醇，其药用机理就是影响真菌甾醇 的生物合成，那么他们是否也影响促性腺激素诱导的甾醇合成。为此，本实验选用小鼠卵母 细胞的体外培养模型，旨在探讨两性霉素B、酮康唑对促卵泡生成素(FSH)诱导卵母细胞成熟 的作用的影响，以揭示抗真菌药物影响生殖功能的机理。

1材料与方法

1．1主要试剂

猪FSH(50 IU／ml)、次黄嘌呤(HX)、牛血清白蛋白v片段(BSA)、L-谷氨酰胺(Glu)、两 性霉素B为S1GMA公司产品，M199培养基、丙酮酸钠购自GIBCO公司。酮康唑为杨森制药有限 公司产品，孕马血清(PMSG)由天津实验动物研究中心提供。

1．2实验动物处理

24～26 d昆明白小鼠，体重14～17 g，购自中国科学院遗传研究所。室温饲养，自由采 食饮水。饲养2～3 d后，腹腔注射PMSG 0．1ml／只(1×10⁵ IU/L)。

1．3卵母细胞的采集及培养

PMSG注射46 h后，颈椎脱臼法处死小鼠，剖开腹腔，取出卵巢，放于含有4 mmol/LHX的 M199培养液(其中含有0．3％BSA，2 mmol/L Glu，0．23 mmol/L丙酮酸钠，1×10⁵ IU/L 青、链霉素，此培养液定名为HX培养液)中，在体视显微镜下，用灭菌5号半注射针头穿刺卵 泡，释放卵丘-卵母细胞复合体(CEO)。选择包裹3～5层卵丘细胞的CEO，在38．5℃的HX培 养液中洗三次，以20～30枚／孔的密度接种于四孔培养板(丹麦Nunclon公司)内，每孔含1 m l HX培养液，在37℃、5％CO₂、饱和湿度的CO₂培养箱内培养24 h。

1．4实验处理

根据不同的实验设计，CEO分别在添加FSH、两性霉素B、FSH+酮康唑的HX培养液及添加 酮康唑的无HX培养液(不含HX，其余与HX培养液同)中培养24 h。培养结束后，用检卵管轻轻 吹打CEO，反复几次，吹去卵母细胞外面的卵丘细胞，观察卵母细胞的生发泡是否存在，以 生发泡破裂(GVBD)作为减数分裂恢复的标志。

1．5数据处理

实验每个处理重复4次，结果以均值±标准差(±s)表示，用t检验进行 统计分析。

2结果

2．1FSH对小鼠卵母细胞减数分裂恢复的作用

FSH对卵母细跑的减数分裂具有明显的促进作用(图1)。CEO在加有FSH(10～200 IU/L)的 HX培养液中培养24 h，各浓度FSH组的GVBD发生率显著升高(48～61％)，均高于对照组(17％ )，其中25～50 IU/L的FSH作用最强。

Fig.1 Effect of FSH on oocyte maturation,

GVBD%(GVBD/total n umber of oocyte,±s,n=4).

^*P＜0.05,vs 0; ^#P＜0.05,vs 100,20 0

2．2两性霉素B对小鼠卵母细胞减数分裂恢复的作用

两性霉素B能像FSH那样，显著提高小鼠卵母细胞减数分裂发生率。0.0025～250 μg/L浓 度的两性霉素B能够剂量依赖性促进CEO恢复减数分裂(P＜0.05)，其中0.025 μg/L的两 性霉素B可诱导42%卵母细胞发生GVBD，高于其它组(P＜0.05)；但是随着两性霉素B的浓 度升高，这种促进作用逐渐降低(图2)。

Fig.2 Effect of amphotericin B on oocyte maturation,

GVBD% (GVBD/total number of oocyte,±s,n=4)

^*P＜0.5,vs 0

2．3酮康唑对小鼠卵母细胞减数分裂恢复的作用

酮康唑(10^-7～10^-3 mmol/L)剂量依赖性地抑制由FSH(50 IU/L)诱导的卵 母细胞减数分裂恢复的作用(P＜0.05，图3A)，10^-5 mmol/L的酮康唑抑制作用达 到最大。但将卵母细胞培养在不加HX的培养基中培养时(自发成熟培养)，酮康唑(10^-7 ～10^-3 mmo/L)并不影响卵母细胞的自发成熟(P＞0.05，图3B)。

Fig.3 Effect of ketoconazole on FSH-i nduce(A) or spontancous(B)

oocyte maturation,GVBD%(GVBD/total number of oocyte)(±s,n=4)

^*P＜0.05,vs 0,10^-5,10^-4,10^-3;^#P＜0.05,vs 10^-6

3讨论

酮康唑等抗真菌药物对生殖的影响很大，但由于其症状常表现在用药的初期，往往被随后 的肝肾损伤而致死亡的症状所掩盖，不被人们重视，缺乏必要的研究。关于它们影响生殖的 机理，多根据它们导致血中睾酮、皮质醇等类固醇浓度降低等症状，推测可能通过抑制胆固 醇的合成或转化，来影响类固醇激素的合成^［1,7］。但对具体的影响途径及配子产 生的直接影响，没能进一步研究。Xia和Byskov等关于促性腺激素在排卵前诱导MAS积聚，进 而诱导卵母细胞成熟的研究结果^［2～7］，为抗真菌药物影响生<