摘要 目的：进一步探讨高压氧治疗脑缺血再灌注损伤，减轻神经元凋亡从 而发挥保护作用的机理。方法：采用“双侧颈总动脉阻断法”前脑缺血模型 ，对沙土鼠前脑缺血20 min后再灌注3 d，并用0.15 MPa和0．25 MPa压力的高压氧治疗(60 m in／d，连续3 d)后，应用免疫组化LSAB方法，观察高压氧对海马CA₁，区神经元凋亡相关 基因bcl-2和bax的蛋白表达的影响。结果：沙土鼠脑缺血再灌注3 d组海马 CA₁区大量神经元表达Bax蛋白，并且神经元发生凋亡，未见神经元表达Bcl-2蛋白；高压 氧治疗组则大量神经元表达Bcl－2蛋白，并且0．25 MPa高压氧治疗组比0．15 MPa高压氧治 疗组变化更显著，而各组表达Bax蛋白的神经元数目无明显变化，但高压氧治疗组Bax蛋白阳 性的神经元形态正常。结论：HBO暴露可诱导大量神经元表达Bcl－2蛋白， 对Bax蛋白表达则无明显作用，使Bcl-2和Bax蛋白表达的比值增高，从而起到保护神经元的 作用，这可视为HBO治疗脑缺血性损伤减少神经元凋亡的机理之一。

中图分类号：R840.5文献标识码： A

文章编号： 1 000-6834(2000)04-0298-04

EFFECT OF HYPERBARIC OXYGEN ON THE EXPRESSION

OF PROTEINS Bcl-2 AND BAX IN THE GERBIL

HIPPOCAMPUS CA₁FOLLOWING FOREBRAIN

ISCHEMIA REPERFUSION

ZHOU Jian-guangLIU Jing-changFANG Yi-qun

（Naval Medical Research Institute of CPLA, Shanghai 200433）

ABSTRACTAim: To study the mechanisms of how hyperbaric oxygen treatment ( HBOT ) reduced neuronal apoptosis following forebrain ischemia reperfusion. Me thods: Changes of the expression of protein Bcl-2 or Bax were observed in CA₁ region of gerbil hippocampus following HBOT on ischemia reperfusion 3 d ays using the method of labelled streptavidin biotin (LSAB)immunohistochemistry stai-ning. For this purpose gerbils were exposed to the 0.15 MPa and 0.25MP a HBO 60min every day for 3 successive days. Results: The expres sion of protein Bcl-2 in hippocampus CA₁ was significantly increased in HBOT groups (P＜0.01), and changes in 0.25 MPa groups were greater than those in 0. 15MPa groups (P＜0.01). The expression of protein Bax in hippocampus CA₁ wa s not changed significantly in HBOT groups. Conclusion: HBO can induce the expression of Bcl-2, which is the mechanism of neuronal protecting e ffect of HBOT.

KEY WORDS:hyperbaric oxygen;forebrain ischemia r eperfusion;Bcl-2;Bax

研究发现bcl-2是主要抗凋亡基因，而bax是促凋亡基因，它们表达的蛋白Bcl-2和Bax的 关系是：两者表达的比值Bcl-2／Bax决定细胞受到凋亡刺激信号后是生存还是凋亡。Bcl-2占优势时细胞存活，Bax占优势时细胞凋亡^［1］。脑缺血再灌注损伤引起Bcl-2基 因的表达，可使细胞存活或延迟死亡，而bax基因的过度表达，则促进细胞凋亡^［2］ 。高压氧(hyperbaric oxygen，HBO)治疗脑缺血已取得明显效果，我们研究发现HBO可以减 少神经元的凋亡，但这种作用的机理还不甚明了。HBO可以通过影响诱导因素而起作用，但 HBO是否对凋亡相关基因的表达也有影响，国内外尚未见报道。因此，我们进行本研究，观 察 HBO作用下脑缺血再灌注海马CAl区神经元Bcl-2和Bax蛋白表达的变化情况，为进一步阐 明HBO的作用及其机理提供新的理论见解。

1材料和方法

1.1动物分组及缺血模型的制备

实验动物用沙士鼠(上海生物制品研究所)，体重60～90 g，雌雄不限。参阅文献^{［ 3］}采用“双侧颈总动脉阻断法”制备前脑缺血模型。实验动物随机分为5组(n=4),静 止观察和检疫一周后进行实验：(1)正常对照组：同样手术，但不夹闭双侧颈总动脉;(2)缺 血组：无创动脉夹夹闭双侧颈总动脉20min，然后再灌注3 d；(3)0.15MPa HBO治疗组：缺血 处理同前，并用0．15MPa HBO治疗，60 min／d，连续3 d；(4)0．25 MPa HBO治疗组：缺 血处理同前，并用0．25 MPa HBO治疗，60 min／d，连续3 d；(5)0．25MPa压力空气(hyp erbaric air，HBA)对照组：缺血处理同前，并用0．25MPa HBA处理，60 min／d，连续3 d。

1．2高压暴露操作

把处理好的动物放入动物加压舱，舱底放置足量钠石灰，用纯氧洗舱10 min，使舱内氧 浓度＞98％， CO₂浓度＜0．05％，以0．11 MPa／min的速率加至实验压力值，在高压下 停留60 min，期间用纯氧通风10 min，停留结束后，匀速减压15 min至常压，出舱。HBA组 所用气体是空气，直接加压至实验压力值，在高压下停留60 min，期间用空气通风10 min， 停留结束后，匀速减压15 min至常压，出舱。对照组动物亦置于加压舱内，模拟除压力和氧浓度外的其它实验过程和环境条件。舱内温度22～24℃。

1．3标本制备

再灌注及高压氧暴露3 d后，用4％多聚甲醛固定液心脏灌流固定，迅速取前脑，冠状切 取前囟后2～5 mm的组织块，固定、系列乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，连续冠状切片( 片厚5μm，隔10张取2张)，常规脱蜡至水。

1.4Bcl-2免疫组化染色

采用LSAB法(LSABkit，Gene Company)染色，切片用PBS洗，经微波抗原修复80℃，15 min ，3％H₂O₂，15 min， PBS洗，正常猪血清20 min，1∶50 Bcl-2单克隆抗体(鼠抗人， Gene Company)37℃ 1 h， PBS洗，1∶400生物素标记的猪抗鼠免疫球蛋白37℃40min，PB S洗，1∶400过氧化物酶标记的Streptavidin37℃孵育40min，PBS洗，DAB显色，苏木精 一过性衬染，脱水，透明，封片。每次染色设阴性对照染色，PBS取代 Bcl-2抗体，其它程 序相同。

1．5Bax免疫组化染色

采用 LSAB法染色，程序同上，但用1：50 Bax单克隆抗体(鼠抗人，Gene Company)取代1∶5 0 Bcl-2单克隆抗体。

1．6数据采集与分析

采用中国科学院通用颗粒分析系统对切片进行数据采集，所有数据均以均数±标准差 (±s)表示，采用方差分析-F检验及Newman-Keuls检验法判断差异的 显著性。

2结果

2．1高压氧暴露下Bcl-2蛋白表达的改变

光镜下Bcl-2蛋白阳性染色呈棕黄色，主要位于细胞质，背景清晰，阳性细胞体积正常，细胞核大而圆(图1)，阴性对照片细胞质和细胞膜不着色。正常对照组海马未见 Bcl-2蛋白染色阳性的细胞；单纯缺血组海马 CA₁区亦未见 Bcl-2蛋白染色阳性的细胞，但该区可见大量细胞被苏木精染色后细胞核固缩、不规则等变化的细胞(图2)。 HBO治疗各组海 马CA₁区可见大量Bcl-2蛋白染色阳性的细胞，0．25MPaHBO治疗组海马CA₁区神经元 Bc l-2蛋白染色呈强阳性，而0．15MPaHBO治疗组海马 CA₁区神经元 Bcl-2蛋白染色强度降 低。0．25 MPaHBA暴露组海马 CA₁区与单纯缺血组海马 CA₁区相似，未见 Bcl-2 蛋白染色阳性的细胞。

Fig.1 Immunohistochemistry staining of Bcl -2 preotein

in the CA₁ region of hippocampus following 0.25MPaHBOT on IR 3 d.

→showing Bcl-2 located in cytoplasm and membrane

of positive staining neuron( ×200)

Fig.2 Immunohistochemistry staining of Bcl-2 protein

in the CA₁ region of hippocampus following IR 3 d,

showing no po sitive staining(×200)

2．2高压氧暴属下Bax蛋白表达的改变

光镜下 Bax蛋白染色呈棕黄色，主要位于细胞质， Bax蛋白染色阳性的细胞主要有两种 ，一种细胞体积正常，细胞核大而圆(图3)，另一种细胞是已经凋亡的细胞，表现细胞缩小 ，细胞核固缩，不规则等变化,Bax蛋白阳性染色呈小块状，细胞内定位不清晰(图4)。阴性 对照片细胞质和细胞膜不着色。正常对照组海马未见 Bax蛋白染色阳性的细胞。单纯缺血组 海马 CA₁区则可见大量Bax蛋白染色阳性的细胞，主要以后一种细胞为主(图4)。各 HBO治 疗组海马 CA₁区也可见 Bax蛋白染色阳性的细胞，但以前种细胞为主(图3)。0．25 M