摘要 目的:通过观察生理范围不同浓度胰岛素对Wistar大鼠主动脉血红素氧合酶-一 氧化碳-环磷酸鸟苷(HO-CO-cGMP)系统活性的影响，以探讨胰岛素与血管舒缩功能的关系 。方法：应用离体Wistar大鼠主动脉组织孵育技术和主动脉平滑肌细胞培养 技术，以胆红素生成量作为HO活性的指标，以培养上清液中碳氧血红蛋白(COHb)含量作为内 源性CO产量的指标，应用放射免疫法测定主动脉环磷酸乌苷含量，从组织和细胞水平观察生 理范围内不同浓度胰岛素对血管局部HO活性，内源性CO产生量和环磷酸鸟苷的影响。结果：生理范围不同浓度胰岛素(0．04、0．08、 0．16 mU/L)使主动脉HO活性 分别增高48．2％、60．8％、80．7%;使主动脉血管平滑肌细胞培养上清中COHb含量增高8． 7％、17．4％、39．1％；使cGMP含量增加96．6％，197．1％，130．7％。结论： 生理浓度胰岛素对正常大鼠血管局部血红素-HO-CO-cGMP系统活性存在浓度依赖 的增强作用。提示在胰岛素引起的血管舒张和低血压中，可能涉及血管局部的HO-CO-cGMP 系统的激活。

中图分类号：Q46，Q26文献标识码：A文章编号：1000 -6834(2000)03-0235-04

EFFECT OF INSULIN ON HEME OXYGENASE-CARBON MONOXIDE-CYCLIC GUANOSINEMONOPHOSPHATE SYSTEM IN RAT AORTA

CHENG you-qin¹,CAO shao-jun¹,WU shan-shan¹,WANG shi-wen² ,CUI ji-jun¹,TANG Chao-shu³

(1.The General Hospital of Beijing Military Command,Beijing 10070 0；2.Wang shiwen,The General Hospital of PLA,Beijing 100853；3.Tang chaoshu,The Beijing Medical University.Beijing 100083)

ABSTRACT

Aim:To investigate the effect of insulin on the HO-CO-cGMP system.Methods:①Isolated wistar rat aortas were cultured in the media containing different concentration insulin (0.04 mU/L,0.08 mU/L,0.16 m U/L) for 24 hours.The relative activity of HO was measured with the bilirubin (p mol/g/h).②The wistar rat aortic smooth muscle cells were cultured in the soluti on containing insulin (consistency same above) for 24 hours.The relative amounts of carbon monoxide released into the media were measured with the quantifying c arbon monoxide hemoglobin (COHb).③Isolated rat aortas were cultured in the medi a containing different concentration insulin (consistency same above) for 24 hou rs.The cGMP content in the tissue of aorta were measured by radioimmunitic metho d.Resultes:In the condition of insulin presenced in the solution (co nsistency as above:0.04 mU/L,0.08 mU/L and 0.16 mU/L):①The HO activities in the aorta were increased to 48.2%,60.8% and 80.7%,respectively (vs control,P＜0. 01).②The COHb in the culture solution of VSMCs were increased to 8.7%,17.4%,39. 1%,respectively(vs control,P＜0.05 or P＜0.01).③The cGMP content in the t issue of aortas were increased to 96.6%,197.1% and 130.7% respectively (vs contr ol P＜0.01).Conclusion:This study suggests that the insulin may a ctivate the HO-CO-cGMP system in Wistar rat aorta.This may be one of the mecha nisms by which insulin causes vasodilation.

KEY WORDS:insulin;heme-oxygenase；carbon-monoxide； vasodilation

近年的研究证实血红素-血红素氧合酶-一氧化碳-环磷酸鸟苷(血红素-HO-CO-cGM P)系统涉及许多生理和病理生理过程。血管壁也存在HO^［1］，内源性CO在血管平滑 肌细胞自分泌作用和在血管内皮细胞旁分泌作用，使这一简单的气体分子在心血管系统的血 管舒张，血压调控中起重要生理和病理生理作用^［2］。

胰岛素是体内重要的激素，它与血管舒缩功能的关系已引起人们关注。但胰岛素与参与 血管舒缩功能调控的血管局部HO-CO-cGMP系统的关系尚未见报道。本实验观察生理范围内 不同浓度胰岛素对基础状态离体Wistar大鼠主动脉HO活性及体外培养Wistar大鼠主动脉平 滑肌细胞内源性CO产生量和cGMP含量的影响，揭示胰岛素血管作用的发生机制，以便进一步 探讨高血压时胰岛素抵抗与高血压发生发展的关系。

1材料与方法

1.1动物与试剂

选用雄性Wistar大鼠(购自中国医学科学院实验动物所)，6周龄，体重80～100 g。胎牛血清 (FBS，购自浙江金华犊牛再利用研究所）；DMEM1640培养液、氯血红素(Hm)、牛血 红蛋 白(Hb)、6-磷酸葡萄糖(G-6-P)、6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G-6-P-D)、辅酶Ⅱ（NA DP)均购自Sigma化学公司。cGMP药盒由北京原子能所提供。实验中所用其他试剂系进口或国产分析纯试剂。

1．2主动脉组织HO活性测定

动物断颈处死，无菌条件速取同等长度主动脉(包括胸、腹主动脉)；用含10％FBS 1640洗净 残血，用滤纸吸干水分，称重,沿纵轴剪开,去除内皮,剪碎,置含10% FBS 1640的12孔培养板 (每孔1条血管),在含CO₂的培养箱中平衡1 h,弃液,加入上述培养液,并按实验分组(每组6 条血管)不加或加入不同浓度胰岛素0.04、0.08、0.16 mU／L，同时加入氯血红素10 μmol/L作为HO的底物。二氧化碳培养箱37℃孵育24 h。实验结束，参照 Mahin等 ^［3］的方法，将血管加入200 mmol/L磷酸缓冲液3 ml，冰水浴中作组织匀浆，4 ℃18 800 g离心10 min，取上清液，4℃100 000 g再离心60 min，将沉淀的微粒体 部分混悬在100 mmol/L磷酸钾缓冲液中。此前参照Tenhunent等^［4］的方法从鼠 肝中粗提纯胆绿素还原酶备用。用Yoshida等^［5］的方法分析HO的活性；终容积 2 ml的反应混合液中含有100 μmol磷酸钾，1 mg胆绿素还原酶，0.2 μ G-6-P-D ，NADP 0.8 mmol/L,G-6-P 1 mmol/L,2.5 mmol/L的氯血红素20 μl,1 ml鼠主动脉 微粒体 部分，反应在37℃避光条件下进行60 min（水浴，摇动），将试管放入冰水中终止反应 。孵育后的混合液用721分光光度仪测定，所形成的胆红素量以在464nm和530 nm吸收 率的不同来确定，应用40 mmol/(L·cm)的消光系数计算，并校正重量。微粒体制剂及粗提 纯胆绿素还原酶制剂中的蛋白浓度用紫外分光光度法测定，计算公式：蛋白浓度C（mg/ml) =1.45×OD280－0.74×OD260。

1.3主动脉平滑肌细胞（AVSMC）培养上清中COHb测定

动物断颈处死，无菌条件速取主动脉，贴块法行AVSMC培养。实验采用6～8代细胞。 制备6×10⁴细胞／ml悬液，接种于24孔板，每孔1ml，含20%FBS的1640培养液孵 育48 h时，换1％FBS1640孵育24 h，弃原液，每孔加10％FBS1640培养液 1 ml，并按以下实验分组(每组6孔)分别加入试剂：C组，对照组，不加胰岛素；实验组IS L1～3组分别加入不同浓度胰岛素0．04、0.08、0．16 mU/L。对照组及实验组均加入氯 血红素10 μmol/L作为底物。孵育24 h，按文献方法［1］实验结束前1 h加入牛 Hb 50 μm ol/L，在GD3022型酶标仪570 nm检测COHb消光数。

1．4主动脉cGMP测定

依1．2所述方法处死动物、处理血管、实验分4组、依所述浓度加入胰岛素和氯血红素，孵 育24 h。实验结束，立即将温育中的血管条放入液氮中。取出后加入3 ml预冷的10％三氯 醋酸，匀浆，3000 r/min离心10 min，取上清，用4倍量的水饱和乙醚洗提4次，除去三氯醋 酸，吸去乙醚，置60℃水浴上吹干，4℃冰箱保存。应用北京原子能所提供的cGMP药盒， 严格按照说明书操作。组织cGMP含量以pmol/g湿组织表示。

1．5统计处理

胆红素和cGMP以均数±标准差(±s)表示，组间比较用SNK检验；COHb以对 照组为100％用相对数表示，组间比较用SNK检验。

2结果

2.1胰岛素浓度与主动脉HO活性的关系

加入梯度浓度胰岛素，主动脉HO活性分别增高48.2％、60．8％、80．7％(P＜0．01，图 1）。

2．2胰岛素浓度与主动脉平滑肌细胞培养上清中COHb生成量的 关系

加入梯度浓度胰岛素，COHb依浓度增高8．7％、17．4％、39.1%(P＜0.05或 P＜0.01，图2）。

2.3胰岛素浓度与cGMP的关系

加入梯度浓度胰岛素，cGMP含量分别比对照组增加96．6％，197.1％和130.7％(P＜001 ，图3)。

Fig.1 Effect of insulin on the heme oxygenase active

^**P＜0.01, vs control

Fig.2 Effect of insulin on COHb concentration in the cult ure solution of VSMCs

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