摘要目的和方法：为探讨血管活性肠肽(VIP)对嗜酸性粒细胞功能的调节 ，采用密度梯度离心法分离健康志愿者外周血嗜酸性粒细胞(Eos)，培养人脐带静脉血管内 皮细胞(HUVEC)，然后分别与VIP和IL-1β共育，再以血小板激活因子(PAF)活化Eos，用嗜 酸性过氧化物酶(EPO)活性评估Eos的过氧化反应和脱颗粒反应，以白细胞单层粘附试验测定 Eos和EC之间的粘附作用。结果：VIP能抑制PAF致Eos的EPO活性增加效应， 抑制Eos脱颗粒反应，对PAF活化的Eos粘附经IL-1β刺激的EC也有明显的抑制作用。结论：VIP对PAF所致Eos功能的易化作用有明显的抑制效应，这一作用可能对变应 性炎症的治疗具有一定的意义。

中图分类号：R331.1⁺42文献标识码：A文章编号：1000-6834(2000)03-0239-04

EFECTS OF VASOACTIVE INTESTINAL PEPTIDE ON DEGRANULATION AND ADHESION OF EOSINOPHILS

WU Chang-gui¹,MAO Bao-ling²,SUN Bin¹

(1.Department of Respiratory Disease,XiJing Hospital,the Fourth Military Medical University,Xi An 710032;2.Institute of Respiratory Disease,XingQiao Hospital,the Third Military Me dical University,Chong Qing 400037)

ABSTRACT

Aim:To investigate the effect of vasoactive intestinal peptide (VIP) on t he function of eosinophils.Methods:Human eosinophils were purifi ed from periperal blood of normal donator using density gradient centrifugation and treated with VIP,and then stimulated by platelet activating factor(PAF).The cultured human umbilical vein endothelial cells(HUVEC) were stimulated by IL-1 β(10u/ml).Eosinophil peroxidase (EPO) assay was used as an index of oxidative b urst and degranulation of eosinophil.Eos adhesion was determined by leukocyte-e ndothelial cell monolayer adhesion asay.Results:VIP could inhibit PA F-induced i ncrease of the EPO activity,and degranulation of eosinophil,VIP also significant ly inhibited adhesion of the PAF-activated eosionophils to the IL-1β-stimul at ed endothelial cells.Conclusion:VIP could attenuate PAF activity tha t increase the oxidative burst and degranulation of eosinophil,and the adhesion of eosinophil to the EC,which may be of significance in treatment of allergic in flammation.

KEY WARDS:vasoactive intestinal peptide;eosinophil;de granulation;adhesion

血管活性肠肽(VIP)是一种主要由VIP能神经释放的28肽，除具有舒张气道平滑肌功能外，还 参与炎症细胞功能的调节。已知它能抑制丝裂原诱发的T-淋巴细胞增殖及某些细胞因子， 尤其是IL-2的合成和释放^［1］，调节自然杀伤细胞活性；抑制单核细胞和中性粒细 胞产生OO^-*₂^［2］。近 年来还观察到其对fMLP激活嗜酸性粒细胞(Eos)释放O^-*₂也有明 显影响^［3］，但其机理尚未明了，VIP对Eos粘附有何影响也未阐明。本实验旨在通 过体外试验而探讨上述诸有关问题。

1材料和方法

1.1人Eos的分离和纯化

取正常自愿者静脉血30 min，注入含2.7%EDTA抗凝的硅化离心管内，加6%Dextran(瑞士，P harmacia公司)及适量Tris缓冲碱，静置45 min，吸取富含白细胞的上层液，加在淋巴细胞 分离液(上海试剂二厂)上水平离心(1 000 r/min, 5 min)，弃去单个核细胞，管底颗粒细胞 用比重1.070 kg/L的percol液(含10%FCS，瑞典Pharmacia公司)调细胞浓度为17.5× 10⁹ cell/L。在10 ml离心管中依次加入以下不同比重的percol液∶1.10液1.0 ml，1. 085液1.5 ml，含待分离的1.070液1 ml，496 g 离心20 min(20℃)，回收1.10和1.08 5 Percol液交界面的细胞层，用Hanks液(含BSA 2 000 mg/L新鲜配制)，稀释至6 ml，496 g 离心20 min弃上清，Hanks液洗涤2次管底细胞团，重悬于Hanks液，调细胞浓度为1.5×10⁶/ml，取少许涂片，Wright染色，作细胞分类，Eos＞95%，苔盼蓝染色检查活力，Eos 活性＞95%。

1.2人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)培养

参照国内张宝庚等方法^［4］，在无菌条件下，取新生儿脐带20 cm，放入4℃无菌PB S中保存，剪去钳子夹痕、血肿和凝血块阻塞部位，以PBS洗涤脐带静脉内的血液，结扎脐带 的一端，然后向脐带静脉内注满0.1%胶原酶(Sigma公司)，将脐带的另一端以钳子夹紧，置 脐带静脉于含PBS的烧杯内，37℃水浴15 min。孵育后倒出消化液，并以适量PBS冲洗之，1 000 r/min离心10 min，弃上清，加入DMEM培养基(含10%FCS，调pH至7.2)，用乳头吸管轻 轻吹打均匀，计数细胞后接种于24孔培养板内，待长至融合状态时作Eos粘附试验用。以Ⅷ 抗原为辨认标志。

1.3白细胞内皮细胞单层粘附测定

参照文献^［5］进行。将预处理后的Eos以Hanks液(含10%BSA)洗涤两次，用⁵¹C r标记(0.2μCi,37℃ 30 min)，再以上述Hanks液洗涤两次，然后取Eos与经预处理的HUVEC 共育10 min(37℃ 5% CO₂条件下)，轻轻摇动弃去未粘附细胞。粘附细胞以 氢氧化铵溶解，使用r-计数器计数CPM。结果以粘附细胞CPM占总加入量的百分比表示。

1.4VIP对EOS过氧化物酶(EPO)活性的影响

取1×10⁹ cell/L Eos悬液45 μl加入55孔反应板中，与5 μl VIP(10⁶～10^-10 mol/L)(Sigma公司)，对照孔中加入5 μl生理盐水，置37℃孵育24 h ，然后以PAF(终 浓度为10^-7mol/L)(Sigma公司)孵育30 min。按 Strath^［6］方法测定EPO活性 。用酶联分光光度计(四医大寄生虫学教研室研制)，在492 nm处测OD值，以OD值表示其活性 。每个VIP浓度级测5孔。

1.5VIP对Eos脱颗粒的影响

在Bppendorf管加入Eos(1×10⁹ cell/L)180 μl和VIP(终浓度为10^-6、10^-8 、10^-10 mol/L)20 μl,置37℃孵育24 h，以PAF(终浓度为10^-6mol/L)孵育30 min，然后以5 000r/min离心5 min(20℃)，弃上清，用PBS轻轻洗涤管底细胞团二次，重悬 于200 μl Hanks液中,用超声粉碎仪5 min破坏细胞，按文献^［6］测EPO。

1.6VIP对Eos粘附功能的影响

1.6.1VIP对PAF激活人Eos粘附性影响Eos(1×10⁹ cell/L)于1 ml 16 40(含10% FCS和终浓度10^-10 mol/L VIP)在 37℃、CO₂ 5%条件下孵育24 h，然后 再加入PAF(终浓度为10^-7 mol/L)在相同条件下共育30 min，按前述方法检测预处理E os对HUVEC(IL-1β刺激后)的粘附功能。

1.6.2VIP对IL-1刺激HUVEC粘附PAF激活Eos功能的影响HUVEC与DMEM( 含10%FCS和VIP10^-6～10^-10mol/L)共育24 h(37℃，5%CO₂)，继以IL-1β(1 0 μ/ml)刺激4 h，检测其对PAF(10^-7mol/L)活化Eos的粘附能力。

为观察VIP的作用机理，实验中还设计了VIP受体拮抗剂和Forskolin对VIP上述功能的影响， 即在相应Eos孔中首先分别以含［4Cl-D-Phe⁶,Leu¹⁷］VIP(10^-5mol/L)和 Forskolin(10^-5mol/L)的10%FCS-DMEM在37℃、5% CO₂条件下预培养2 h，然后再按 上述程序加入VIP和PAF孵育后分别进行检测。

1.7数据处理

数据用均数±标准差(±s)表示，两均数间比较用t检验。

2结果

2.1VIP对Eos的EPO活性的影响

PAF(10^-7mol/L)能明显增加Eos的EPO活性，10^-6～10^-8mol/L VIP对PAF 的激活效应有显著抑制作用(P＜0.01)，且呈剂量依赖性。低于10^-8mol/L时此 抑制作用消失(图1)。

2.2VIP对Eos脱颗粒的调节作用及VIP拮抗剂(4Cl-D-Phe⁶, Leu¹⁷)VIP和AC激活剂Forskolin对VIP影响

10^-6～10^-7mol/L VIP能明显抑制PAF(10^-6mol/L)所引起的Eos脱颗粒反 应(P均＜0.01)，VIP受体拮抗剂((4Cl-D-Phe⁶,Leu¹⁷)VIP(10^-5mol) 明显抑制了VIP(10^-6mol/L)的效应，Forsklin(10^-5mol/L)对VIP(10^-6m ol/L)作用有显著的增强效应(图2，3)。

Fig.1 Influence of VIP on pAF-induced increased activily of eosinophil peroxidase<