摘要 目的：观察维拉帕米（verapamil,VP)对三磷酸肌醇（IP₃)引起的大鼠肝 细胞钙释放激活的钙电流（I_CRAC）的影响。方法：采用标准全 细胞膜片钳技术。结果：IP₃激活的I_CRAC的峰电流为（-0.26±0.08)nA(n=7); 5 μmol/L维拉帕米对I_CRAC的抑制率为30.9%±7.8%(从-0.25±0.10nA到- 0.17±0.05nA,n=5,P＜0.01)。结果：维拉帕米能有效抑制IP₃ 引起的I_CRAC。

中图分类号：R333，4

文献标识码：A

文章编号：1000-6834(2000)03-0265-03

EFFECTS OF VERAPAMIL ON CALCIUM RELEASE-ACTIVATED CALCIUM CURRENTS CAUSED BY 1,4,5-TRIPHOSPHATE IN RAT HEPATOCYTES

CUI Hong¹, CUI Gui-ying², LIU Dong-ju¹, TENG Rui-feng³, HAO Li-ying⁴, LI Jin-ming⁴

(1.First department of general surgery, First clinical college； 2.Department of physiology；3.Department of general surgery, Third clinical college； 4.Department of pharmacology, China Medical University, Shenyang 110001)

ABSTRACT

Aim and Methods:Whole-cell patch clamp techniue was employed to investiga te the influence of verapamil on calcium release-activated calcium currents(I CRAC) caused by 1,4,5-triphosphate (IP₃) in rat hepatocytes. Result s: The peak amplitude of IP₃-activated I_CRAC was -0.26±0.08 nA( n=7); The inhibitory rate of 5 μmol/L verapamil on I_CRAC was 30.9±7. 8%(from -0.25±0.10 nA to -0. 17±0.05 nA, n=5, P＜0.01). Conclusio n: The results showed that I_CRAC was a calcium current activated by depletion of intracellular calcium stores caused by IP₃. Verapamil could prote ct hepatocytes from calcium overload via the inhibition of I_CRAC.

KEY WORDS: calcium channel; verapamil; patch-cl amp;liver

肝移植的关键是肝脏的保存，但低温、缺血、缺氧引起的细胞内钙超载导致细胞损伤和死亡 。钙拮抗剂能通过抑制肝细胞钙超载而保护细胞^［1］。大鼠肝细胞由于缺乏电压依赖性钙电流，钙内流主要依靠受体调控的钙电流，即钙释放激活的钙电流(I_CRAC) ［ 2］。1，4，5-三磷酸肌醇(IP₃)是一种细胞内第二信使，它引起细胞内钙池释放钙离 子。通过钙释放激活的钙通道的钙跨膜内流在小脑浦氏细胞证明与磷酸苷的转化有关^{［ 3］}，但IP₃在大鼠肝细胞钙内流的激活中的作用尚不清楚。本文旨在探讨 IP₃对大 鼠肝细胞 I_CRAC的激活的作用及维拉帕米对I_CRAC的影响。

1材料与方法

1.1溶液及药品

Hanks’液(mmol/L)：NaCl 137，KCl 5．4，CaCl₂ 1．0，MgCl₂ 1．0，NaH₂PO₄ 0．5，Na₂HPO₄0．58，NaHCO₃ 4．16，glucose 5．5。去除Ca²⁺和 Mg 2+制成无钙镁Hanks’液。KB液(mmol/L)：glutamic acid 70，taurine l5，KCl 130，KH ₂PO₄ 10，HEPES 10，MgCl₂ 0．5，glucose 11，EGTA 0.5。细胞外液(mmol/L)：NaC l 140，KCl 2．8，Cal₂ 10,MgCl₂ 0．5，glucose 11，HEPES 10。细胞内液(mmol/L): P otassium-Glutamate 145,NaCl 8,MgCl₂ 1，Mg-ATP 0.5，IP₃ 0.01,HEPES 10。以上 液体均调至pH7．2。维拉帕米(北京天丰制药厂)，IP₃(Sigma)。

1．2大鼠肝细胞的分离^［4］

雄性 Wistar大鼠(175±25)g(中国医科大学实验动物中心提供)。用乙醚吸入和苯巴比妥钠3 0 mg/kg腹腔注射麻醉。门静脉插管，切断肝上、肝下下腔静脉，切取肝脏置于4℃保存液中 。分三步灌流鼠肝，先用充氧的Hanks’液于37℃灌流4～5 min，然后用无钙镁含胶原酶Ⅳ( 0.5 g/L)的Hanks’液灌流10～15 min,最后用无钙镁Hanks’液灌洗1 min并迅速置入4℃ KB 液中，机械剥离肝被膜，搅打、分散，用105 μm的筛网过滤，制成的肝细胞放在DMEM(Dulb ecco’s modified Eagle medium)于4℃冰箱中备用。

1．3I_CRAC的记录

将适量细胞加入体积约1．5 ml平放于倒置显微镜上的细胞池中，静置10 min细胞贴壁后， 用细胞外液灌流，流速约2．5 ml／min。电极分两步拉制,电阻3～5 MΩ，采用全细胞高阻抗封接技术。应用PCLAMP5．5．1程序(Axon Instrument，美国)通过AD/DA转换板(Digiata1 200，美国)支持Axopatch、1 D(Axon Instrument，美国)进行刺激发放和信号采集，并存 储于IBM兼容机硬盘中。记录I_CRAC时，保持电位在0 mV，指令电位-100～80 mV，去 极化实验脉冲持续20 ms。

1．4数据处理

数据用均数±标准差(±s)表示，显著性检验用t检验。

2结果

在钳制电位0 mV，指令电位-100～80 mV，去极化实验脉冲持续200 ms的条件下记录到I _CRAC(图1)。从I-V(电流-电压)关系曲线可见I_CRAC的反转电位为10 mV左右。 在-100 mV时，I_CRAC内向电流最大，约为(-0．26±0．08)nA,n=7)。在指令电位 -100 mV时，5 μmol/L维拉帕米降低I_CRAC30．9%±7．8％(从-0．25±0．10 nA至-0 ．17±0．05 nA，P＜0．01，n=5)(图2为其中一例)。

Fig.1 A:Ca²⁺ release-act ivated Ca²⁺ curents(I_CRAC) in isolated rat hepatocytes induced by i nositol 1, 4, 5-triphosphate (IP₃) 10 μmol/L in the internal solution. B: Cu rrent-vol-tage (I-V) relationship of I_CRAC. (Voltage ramps were of 200 ms duration from holding potential 0 mV and applied every 5 s, covering a range o f -100 to +80 mV)3讨论

I_CRAC的激活是细胞内钙库耗竭的结果，任何能引起细胞内钙库耗竭的因素均能 引起I_CRAC的产生^［5］。本组应用钙络合剂耗竭细胞内钙显著激活I_{CRA C}，且研究表明三种钙通道阻滞剂维拉帕米、硝苯地平、地尔硫卓均显著抑制I_CRAC ，其中维拉帕米作用最显著^［6］。文献报道IP₃激活小脑浦氏细胞的I_{CRA C}，但它对肥大细胞I_CRAC的激活无效。本文结果表明IP₃能激活大鼠肝细胞的I CRAC且维拉帕米显著抑制IP₃激活的I_CRAC。提示生理状态下钙通道阻滞剂可能 是通过抑制I_CRAC使细胞内钙减少而具有肝细胞保护作用。

Fig.2 Effects of verapamil 5 μ mol/L on I_CRAC induced by IP₃ in isolated rat hepatocytes(±s )

A: Control;B:Verapamil: 5 μmol/L;C:Current-Voltage relationship of I_CRAC obtained from records of A and B.(○)control, (●)ve-rapamil.(^**P ＜0.01, vs control)

细胞内钙库耗竭产生I_CRAC的机制，目前认为是钙库耗竭产生的信号诱导I CR AC的激活，但这个信号迄今尚未证实。有三种机制值得考虑：(1)细胞器跨膜蛋白与胞浆 钙通道的直接偶联；(2)通过酶反应的同族机制如细胞器酶引起的胞浆膜通道磷酸化或脱磷 酸化；(3)细胞器内一个未知的信号转导链产生的未知的信号分子的间接激活^［7］。 第二种机制认为内储钙池激活时，有某种可溶性信使物质从钙池释放或合成后释放入胞浆， 再将信号传至质膜。直至目前己相继提出了十余种小分子物质起着信使的作用，如钙内流因 子(CIF)，酪氨酸激酶，cGMP,cAMP,IP₃，IP₄等，但至今无一被认可。本实验的结果可 以证实IP₃可能作为一个信使在起作用。

基金项目：国家自然科学基金资助课题（39400138）

作者简介：崔宏（1963－），男，辽宁省昌图县，讲师，博士，从事肝脏移植研究。

参考文献

［1］ Sippel H, Stauffert I, E