摘要 目的：研究前庭毛细胞的细胞活性及膜上钾通道的类型。方法：用酶 消化后机械法分离豚鼠球囊毛细胞，并用全细胞膜片钳技术观察豚鼠球囊Ⅱ型毛细胞侧膜上 的钾通道电流。结果：①胶原酶Ⅳ浓度为0.35 mg/ml时，分离的毛细胞数量最 多，存活时间最长；②当钳制电位为-100 mV，以10 mV的步距，从-70 mV至+20 mV阶跃，随 着 膜电位的去极化，可记录到一系列快速、瞬时的以A型钾通道为主的外向电流，4-Ap对其有 特异性阻断作用。激活电压为-60～-50 mV；③当钳制电位为-70 mV，以10 mV的步距阶跃去 极化(-50 mV～+40 mV)，可产生一系列延迟整流性钾离子流，TEA能使该电流幅度下降53.3 %±6.0%。结论：分离豚鼠球囊毛细胞酶的最佳浓度为0.35 mg/ml,Ⅱ型毛细 胞膜上有A型钾通道和延迟整流性钾通道。

中图分类号：Q2；Q437文献标识码：A文章编号 ：1000-6834(2000)03-0279-04

THE STUDIES OF CELL ISOLATION AND POTASSIUM CURRENTS IN GUINEA-PIG SACCULAR HAIR CELLS

SHA Jian-hui,Li yun-yi, LI Yun-ge, LIU Huan-zhu, WANG Qing

(Department of Physiology,Fourth Military Medical University,College of Medicine at Jilin,Jilin City, 132013)

ABSTRACT

Aim:To study the cell viability in the guinea-pig's saccular hair cells and the type of potassium channels on their membrane.Methods:En zymatic and mechanical dissociation were used to separate guinea-pig's saccular hair cells and whole cell patch-clamp technique was used to observe potassium current on guinea-pig's saccular Ⅱ type hair cells membrane. Results:①When the concentration of collagenase Ⅳ was 0.35 mg/ml,single living hair cells were the most numerous and the longest in survial.②A series of rapid and instant outward currents of which were A-type of potassium channel mainly could be recorded when the holding potential was at -100mV and the depolarized poten tials from -70 mV to +20 mV were in 10 mV increments.They could be blocked by 4 -Ap especially.The activated membrane potential was (-60～-50)mV.③When the hol din g potential was at -70 mV and the depolarized potentials from -50 mV to +40 mV w ere in 10 mV increments,depolariztion could produce a series of delayed rectifie r potassium currents .TEA could decrease it by 53.3±6.0%.Conclusion: The enzymatic concentration of 0.35 mg/ml could achieve the best result in iso lating saccular hair cells of guinea-pig.There are A-type and delaged rectifie r potassium channel on guinea-pig's saccular Ⅱ type hair cells' membrane.

KEY WORDS:saccule;hair cells;K⁺currents;patc h clamp

为了从细胞水平上探讨前庭的生理机能和前庭系统疾病的致病机理，前庭毛细胞的分离技术 及离子通道的研究十分重要。目前，关于毛细胞的分离技术，国内曾有报道^［1，2］ ， 但选用消化酶的种类及浓度各不相同。近十余年来，相关离子通道研究的迅速发展，深入揭 示了毛细胞进行机械电换能的分子机制^［3，4］，即静纤毛的换能通道产生感受器电 位、侧膜离子通道的调节作用及突触释放递质这样三个互相关联的过程。通过膜片钳技术研 究前庭毛细胞离子通道的机能活动，国内仅报道了应用单通道膜片钳技术对牛蛙球囊钾通道 和钙通道的研究^［5，6］。记录到钙依赖性钾通道(K_ca)，但对豚鼠球囊毛细 胞钾通道的研究尚未见报道，为了获得较多具有活性的单个前庭毛细胞，进一步揭示哺乳动 物前庭毛细胞中钾离子通道的类型，以便为机械电换能机制的研究提供实验依据，我们采用 酶消化辅以机械法分离豚鼠球囊毛细胞，并用全细胞膜片钳技术观察了豚鼠球囊毛细胞的钾 离子通道电流。

1材料和方法

1.1毛细胞的分离

选用耳廓反射正常的成年花色豚鼠42只，雌雄不拘，体重250～300 g。培养液为Hank＇s液( mmol/L):NaCl 137.0、KCl 5.4、CaCl₂ 1.3、MgSO₄ 0.8、Na₂HPO₄ 0.4、KH₂HPO ₄ 0.4、Glucose 5.0,HEPES 5.0，用1 mol/L NaOH调节pH至7.4，然后用4 mol/L NaCl将 渗透压调节为300 mOsm。含酶液由无钙、镁的Hank＇s液加胶原酶Ⅳ(Sigma公司)配制而成， 酶浓度分别为0.2、0.35、0.5 mg/ml。动物断头后取出两侧听泡，剪开前庭骨质，置于H ank＇s液中，在解剖显微镜下取出球囊斑，分别置于不同浓度的酶溶液中，35～37℃下孵育 50～60 min，间断给氧后用微量吸管反复机械吹打，直至组织块离散，将此细胞悬液移至含 有盖玻片的培养皿中，盖玻片预先涂有刀豆球蛋白，静止20～25min,待细胞贴附后，用Hank ＇s液清洗三次，去酶后在倒置显微镜下，观察毛细胞的形态、分类，再 于孵育后2、3、5、7 h分别观察不同酶浓度下毛细胞成活率及变性情况。选择活性良好的Ⅱ 型毛细胞进行离子通道实验。

1.2离子通道电流的记录

记录用的微电极由软质玻璃经玻璃微电极拉制仪(Narishige PB-7,Japan)制成，其尖端内径 约1 μm,电极阻抗3～5 MΩ，电极内液(mmol/L):KCl 140,MnCl₂ 2,CaCl₂ 1,EGTA 11,H EPES 10,用 KOH将pH值调至7.4，渗透压调至300 mOsm，电极充灌前液体经0.22 μm的滤器过滤，在微 操纵器(MO-202，Japan)控制下，逐步推进电极至尖端接触细胞侧膜，稍加负压，获得1～5 GΩ以上的封接电阻，给电极内增加负压，电极尖端膜片破裂，形成了全细胞式记录方式。 补偿电容电流及电极串联阻抗，信号经Ag/AgCl电极引导，由膜片钳放大器(ECZ 2300)放大 ，滤波为1 kHz。为了防止细胞外液中钙产生的内向电流的影响，细胞外液中加入79 μmol/ L异搏定(江苏连云港制药厂生产)。

1.3数据分析

实验过程由pClamp6.01(Axon Instrument,INC)控制，通过放大器及A/D、D/A转换控制刺激 的连续发放、信号采集和数据分析，并将信号存贮于486计算机硬盘中进行分析。统计数据 以均数±标准差(±s)表示。

2结果

2.1正常球囊毛细胞的形态特点

豚鼠球囊毛细胞膜光滑，胞浆透明，细胞分为两型：Ⅰ型细胞呈烧瓶状，核位于基底部，细 胞中部有明显的颈，颈顶端有皮板和一束纤毛，颈和纤毛长度各异，细胞底部到皮板的长度 为(19.32±1.57) μm(n=29);Ⅱ型细胞体呈椭圆或圆形，比Ⅰ型细胞小，核位于中央，也 有皮板及纤毛，胞体长度为(14.11±2.69) μm(n=14)，细胞器主要位于皮板处，纤毛 从动毛向静毛侧按长短顺序排列。Ⅰ、Ⅱ型细胞的比例是65∶35(n=8)。

2.2球囊毛细胞的变性表现

失活的毛细胞早期变化是胞内出现颗粒，细胞膜不平，以后是颈部(Ⅰ型)消失或纤毛脱落， 最后是细胞水肿，胞浆外溢。

2.3不同酶浓度下单个毛细胞数及存活时间

在室温下(22～24℃)培养期间，当酶浓度较低(0.2 mg/ml)或较高(0.5 mg/ml)时，分离的 毛细胞数均较少(分别为15±7个，n=7；19±1个,n=7)，存活时间达7 h的也较少(1 2%；2%)。当酶浓度为0.35 mg/ml时，分离的毛细胞数最多(27±2个，n=8)存活时间也 最长，存活超7 h的达21%。

2.4A型钾离子流(I_A)的分析

实验记录了14个毛细胞，钳制电位在-100 mV，阶跃由电位-70 mV开始至+20 mV，间隔10 mV，脉冲保持时间200 ms。随着膜的去极化，在毛细胞侧膜上可记录到一个电压依赖性复合 外向电流，这个外向电流以快电流为主(图1A)，最大去极化电流的峰值范围为0.9～1.4 nA 。去极化电压越靠近正值，电流激活速度越快。电压激活范围为-50～-60 mV，向细胞 外液 加入4-Ap(四氨基吡啶，Sigma公司，浓度为16 mmol/L^［7］)，2 min后，复合的外向 电流中快速激活又很快失活的外向电流部分逐渐消失(图1B)，剩余有缓慢激活、持续时间较 长的外向电流。

Fig.1 Complex outward current contained I _A and effect of 4-Ap on I_A(A):Complex outward current contained I_A;(B):I_A was blocked by 4-Ap

从上述图1A的图形特点及Ⅰ_A特异性阻断剂4-Ap削减了快速激活又很快失活的外向 电流部分，初步推断外向电流中含有Ⅰ_A。

2.5延迟整流性钾电流(Ⅰ_k)

当细胞外液加入4-Ap(16 mmol/L)后，钳制电位在-70 mV，阶跃由电位-50 mV至+40 mV，脉 冲保持时间为400 ms，在8个毛细胞侧膜上，可记录到缓慢激活