摘要 目的：探讨实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)时，中枢和外周儿茶酚胺水平的变化规律，为神经系统自身免疫性疾病的发病机制和治疗的进一步研究提供实验依据。 方法：用豚鼠脊髓加完全弗氏佐剂制成抗原佐剂乳化物诱导 Wistar大鼠发生EAE。在 EAE 2级和3级临床症状时，用高效液相色谱-电化学检测法(HPLC-ECD)测定下丘脑、海马 、肠系膜淋巴结和血清中去甲肾上腺素(NA)、多巴胺(DA)和肾上腺素(A)的含量。结 果：①诱导大鼠 EAE，一般在注射抗原佐剂乳化物两周后开始出现症状，2 级症状 为后肢无力，3 级症状为后肢瘫痪；② EAE 2 级和3 级症状时，下丘脑和海马中 NA含量都 明显降低，而肠系膜淋巴结中 NA含量显著升高，且症状越重，NA含量变化越大；③ 3 级症状的 EAE大鼠，下丘脑、海马和淋巴结中 DA含量都显著增加，而在 2 级症状时，只有淋 巴结中 DA含量明显增加；④2级症状的 EAE大鼠，血清中 A含量高于正常大鼠近2．5倍，3 级症状的 EAE大鼠，血清中 A含量高于正常近3倍。EAE大鼠淋巴结中 A含量也升高，但升高 幅度没有血清中的大。结论：大鼠 EAE疾病时，主要伴有中枢 NA降低，外 周儿茶酚胺升高，且EAE症状越重，儿茶酚胺含量的变化越大，这可能有利于EAE疾病的恢复 。

中图分类号：R392文献标识码：A文章编号：1000- 6834(2000)03-0210-04

CHANGES OF CATECHOLAMINE CONTENT IN CNS AND PERIPHERY OF RATS IN EXPERIMENTAL ALLERGIC ENCEPHALOMYELITIS

PENG Yu-ping,QIU Yi-hua,CHENG Chun,LI Bing-yuan,DAI Li,HUANG Hui -wei

(Department of Physiology,Nantong Medical college,Nantong 226001)

ABSTRACT

Aim and Methods:Experimental allergic encephalomyelitis(EAE) was induced with th e guinea pig spinal cord in Freund's complete adjuvant,and the changes of noradr enaline (NA),dopamine (DA)and adrenaline (A) were determined in the hypothalamus , hippocampus,lymphaden and serum of Wistar rats at EAE clinical degree two and three in order to demonstrate the relationship between the catecholamines and di sease course of EAE.Results:①EAE clinical signs accompanied by demyelin alterat ions in the central nervous system (CNS) appeared about on the 15th day and the peak signs were on the 19th day after the Wistar rats were injected antigen.The clinical sign of weak hind limbs was marked as EAE symptom degree two and the si gn of paralytic hind limbs marked as EAE symptom degree three.② NA content in t he hypothalamus and hippocampus significantly decreased and markedly increased i n the mesenteric lymph node of EAE rats.The NA changes were stronger at symptom degree three than at symptom degree two.③ Increased DA levels were observed in the hypothalamus,hippocampus and mesenteric lymph node at clinical degree three, whereas at clinical degree two,only in the mesenteric lymph node, DA was signif icantly elevated.④ In EAE rats,there was a striking augmentation of serum A con tent which was nearly 2.5 times at clinical degree two and nearly 3 times at cli nical degree three as high as that in normal rats.Conclusion:EAE disease is mainly accompanied by NA reduction in CNS and catecholamine enhancem ent in periphery there are a positive correlation between catecholamines and dis ease severity,which may contribute to recovery.

KEY WORDS:experimental allergic encephalomyelitis;catec holamine;hypothalamus;neuroimmunomodulation

实验性变态反应性脑脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis，EAE)是人类中枢神经系统(central nervous system，CNS)自身免疫性脱髓鞘病的最佳模型，它与多发 性硬化、急性播散性脑脊髓炎等神经系统自身免疫性疾病有相同的临床、生化、免疫和病理 特征^［1］。因此在临床神经免疫学的研究中具有很重要的意义。Leonard等人在199 1年报道^［2］，脑内注射6-羟基多巴胺(6-OHDA)使下丘脑去甲肾上腺素(noradren aline,NA)减少80％，导致 EAE临床症状减轻，而腹腔注射6-OHDA耗竭脾脏 NA，导致EAE症状加重。说明中枢和外周 NA都与 EAE有关。但此后未见有这方面的报道。另有众多的研究 表明，下丘脑和海马是调节免疫功能的重要中枢^［3,4］，在淋巴组织中，也有丰富的自主神经系统分布^［5,6］。因此，我们选取中枢下丘脑和海马，及外周肠系膜淋 巴结和血清，探讨这些组织中 NA、多巴胺(dopamine，DA)、肾上腺素(adrenaline，A)与EA E疾病的关系，为神经系统自身免疫性疾病的发病机制和治疗的进一步研究提供一些实验依据。

1材料和方法

1．1EAE动物模型的制备

1．1．1动物 Wistar大鼠，体重180～230 g，雌雄不拘，购于上海医科 大学实验动物中心。大鼠分成两组，一组为对照，一组制备 EAE动物模型。取2级和3级 EAE 症状的大鼠各5只进行儿茶酚胺含量测定，并各取2只进行病理标本制备，另有4只 EAE动物 观察其疾病的全过程至42 d。豚鼠，体重300～350 g，由南通医学院实验动物中心提供。

1.1.2抗原佐剂乳化物的制备无菌取出豚鼠脊髓，剥去周围包膜，称重 ，按重量体积比加入生理盐水制成浓度为50％的脊髓匀浆，此匀浆再与完全弗氏佐剂(compl ete Freund’s adjuvant，Sigma)等量混合，并用注射器反复抽打，最终制成油包水的乳 剂。

1．1．3EAE的诱导 Wistar大鼠背部皮肤常规消毒后，进行皮下多点注射 (5～6点)抗原佐剂乳化物共0．5 ml。注射后动物单笼饲养，给予自由进食和饮水，并每日 观察动物的饮食、活动和体重等情况。

1．1．4EAE神经症状分级根据Kono等人^［7］的标准略加修改，定 为0～5级。0级：无异常，1级：尾巴麻痹，2级：后肢无力，3级：后肢瘫痪，4级：后肢和 前肢均瘫痪，或人为翻身后不能复位，5级：动物死亡。

1．1．5EAE病理标本制备 断头处死 EAE大鼠，取其脑和脊髓固定在10％ 的甲醛溶液中，常规脱 水、透明、浸蜡、石蜡包埋和切片(8 μm厚)。切片后烘干、脱蜡 和HE染色。

1．2HPLC-ECD法检测中枢和外周儿茶酚胺含量

1．2．1动物样品处理大鼠快速断头放血，并在冰盘上迅速分离出下丘脑 、海马和肠系膜淋巴结，用滤纸吸干组织表面水分和血液，称重，以1∶10(w∶v)加入高氯 酸组织提取液(0．4 mol/L高氯酸溶液内含0．1 mmol/L EDTA)，制成匀浆，离心(16 000× g)15 min，取上清液经0．22 μm膜过滤后40μl进样分析。

吸取血清0．5 ml，加入 Tris缓冲液(1 mol/L，pH 8．0)0．5 ml，加入内标(2，4- 二羟基卞胺50 ng／ml)0．1 ml，加入10 mg活化氧化铝，振摇15 min，弃上清夜，用纯水 洗氧化铝3 次，离心，弃上清夜，加入0．1 mol/L高氯酸0．5 ml 振摇，离心，吸取上 清液 100 μl进样分析。

1.2.2试剂NA、DA、A和2，4－二羟基卞胺均为Sigma产品。

1.2.3色谱分析条件HPLC系统为美国 Waters公司产品：510泵，710B 自动进样器，746电化学检测器，820工作站。色谱柱为 Nov-pak C₁₈柱，3．9×15 0 mm，4μm(Waters公司产)。工作电极为玻璃碳电极，参比电极为 Ag／AgCl电极，工作 电压 0．65 V。流动相为0．03 mol/L 乙酸钠缓冲液-乙晴(1∶ 0．5)溶液。乙酸钠缓冲 液中含有3 mmol/L B₈和 0．1 mmol/L EDTA，pH3．85，超声波脱气。流动相流速1．0 ml／min，分析周期为35 min。

1．3统计学处理

实验结果用均数±标准差(±s)表示，用方差分析和q检验(Newman-Ke uls法)比较各实验组与对照组之间的差异有无显著意义。

2结果

2．1大鼠诱导EAE的发病情况和CNS的病理改变

大鼠诱导 EAE，一般在注射抗原佐剂乳化物两周后开始出现症状，在注射后19 d左右症 状最明显，表现为进食减少，体重减轻，尾巴拖地不能抬起，后肢无力和跛行，后肢完全瘫 痪等。症状持续5 d左右后逐步缓解，发病两周后可恢复正常。

在EAE大鼠的 CNS中，可观察到脑血管周围明显的炎性细胞浸润，构成袖套征(图1 ），中性粒细胞侵入神经细胞内构成噬神经细胞现象;在变性的神经细胞周围有增生的少突 胶质细胞围绕构成卫星现象;以及变性坏死的神经细胞出现核溶解和核固缩等典型的脑炎症 状。

Fig.1 Pathological alterations in the brain of EAE rat ( ×66)

2．2EAE大鼠中枢和外周NA