淋巴细胞是直接参与机体免疫的重要效应细胞。淋巴细胞膜上存在多种离子通道,其中 主要为电压依赖性钾通道。目前，对鼠淋巴细胞该通道的研究较深入，它可分为n、n'和l型 三种亚型，但对人外周血淋巴细胞膜上钾通道的研究较少。国内尚未见这方面的报道。本文 采用膜片钳技术记录人外周血淋巴细胞电压依赖性钾通道电流，并对其进行特性分析，为研 究其异常变化与某些疾病的关系提供实验依据。

1材料和方法

(1)细胞的分离取正常人外周静脉血，用Ficoll密度梯度离心法分离出单个核细胞，将其 置于塑料平皿内，37℃孵育2 h，取含淋巴细胞的悬液，弃去贴壁的单核细胞。(2)膜片钳记录方法将分离的淋巴细胞置于浴液中，细胞浴液组成(mmol/L)：NaCl 140、K Cl 4、MgCl₂ 1、CaCl₂ 1、葡萄糖10、HEPES 10、NaOH调至pH7．2。电极内充灌电极液 ，电极液(mmol/L)：KCl 90、KF 50、NaCl 4、MgCl₂ 4、CaCl₂ 0．5、EGTA 5、HEPES 10缓冲液，KOH调至pH 7．2。电极电阻为3～6 MΩ，在显微镜监视器的监视下使微电极尖端 与细胞膜紧密接触，形成千兆欧姆的封接电阻。通过微电极给细胞膜以负压吸引，使电极尖 端处细胞膜破裂，形成全细胞记录。实验过程中室内温度控制在20～23℃。

(3)钾通道特性的观察①钾通道的激活电压保持电压为-80 mV，并从此阶跃到+80 mV， 增益为10 mV，每次阶跃持续200 ms，观察钾通道的激活电压。②钾通道失活特性观察在 持续去极化状态下通道的失活特性。从保持电位-80 mV，阶跃到+40 mV，每次持续200 ms， 反复10次，频率为1 Hz。③通道关闭动力学特性膜电位保持在-80 mV，然后阶跃到+40 m V、15 ms，使所有通道开放，然后阶跃回-60 mV，观察在复极过程中通道关闭的时间常数。 ④TEA的阻断作用首先记录到K⁺电流，然后向溶液中加入TEA，使其在浴液中浓度为10 m mol/L，观察TEA对K⁺通道的阻断作用。

(4)数据的采集和处理将记录到的全细胞电流输入膜片钳放大器，然后输入IBM计算机， 经模／数(A/D)转换将电压脉冲信号转换成数字信号，用Pclamp 6．0软件控制数据的采集， 频率为1 Hz，并存入硬盘。数据以均数±标准差(±s)表示，两组均数比较用 双侧t检验法。

2结果

(1)钾通道的激活电压在观察到的23个细胞的钾通道中，激活电压为(-43.3±2.5)mV(图 1，图2)。

Fig.1 Whole cell K⁺-current of a human peripheral lymphocyte

Fig.2 I-V curve of K⁺-current

(2)钾通道的失活特性对上述23个细胞的钾通道连续给予1 Hz、持时200 ms的+40 mV的 重复去极化刺激(10次)，均无失活现象(图3)。

Fig.3 Inactivation p roperty of K⁺-channel

(3)通道关闭动力学特性上述23例钾通道的关闭时间为(116．3±8．2)ms。

(4)TEA对钾通道的阻断作用对上述23例钾通道，首先记录正常钾电流，其幅值为 (258 ．2±112．5)pA，向浴液中加入TEA(终浓度为10 mmol/L)后，其幅值下降为(81．9±66．7 pA)，与给药前相比P＜0．05(图4)。

Fig.4 Block effect of TEA on K⁺-channel

3讨论

淋巴细胞膜K［v］通道的主要作用是控制膜电位，调节细胞体积，及在淋巴细胞活化过 程中起重要作用。近年来的一些研究表明，K［v］通道特性的异常变化与一些自身免疫性疾 病相关。因此，K［v］通道的正常表达是淋巴细胞发挥免疫功能的前提和基础，研究淋巴细 胞膜上K［v］通道特性对研究正常人的免疫过程及一些免疫相关疾病的发生具有一定的意义 。

依据有关文献，我们在激活电压、通道失活特性、通道关闭动力学以及对TEA的敏感性 等几个方面对记录到的钾电流进行特性分析，鼠n型钾通道的激活电压在-40 mV以上，在1 H z的重复去极化刺激下表现为失活，复极过程中通道关闭较慢，TEA半数阻断剂量为10 mmol ／L，而我们观察到的外周血淋巴细胞膜钾通道电流性质是激活电压接近-40 mV，对TEA较敏 感，可被10 mmol/L的TEA所阻断，在复极(-60 mV)过程中通道关闭时间为(116．3±8．2)ms ,其主要特性与鼠n型K⁺通道特性相似。

Cahalan等人报道，人淋巴细胞膜K(v)通道的激活电压为(-36±1.5)mV，在复极-60 m V时的关闭时间常数为123 ms，TEA的半数阻断剂量ki为8 mmol/L,与我们所记录到的K(v)通 道性质相类似，但他们观察到K(v)通道在+40mV的持续去极化状态下表现出失活,时间为(1 78±3)ms,与我们所记录到的K(v)通道在200 ms，+40 mV去极化状态下无失活不同，可能由 于国人K(v)通道的表达不同于其他种族，其确切原因有待进一步探讨。

(收稿日期:1999-12-27;修回日期:2000-04-27)