摘要 目的和方法：利用激光扫描共聚焦显微镜和双波长荧光分光光度计，分别观察牛 磺酸对无血清培养的单个海马神经细胞和分散的新生大鼠脑神经细胞内Ca²⁺浓度(［C a²⁺］_i)的影响，并探讨牛磺酸调节神经细胞内钙稳态的作用机理。结果： 牛磺酸主要通过刺激细胞内钙库释放，在一定剂量范围内(0．02～6．4 mmol/L)使 神经细胞［Ca²⁺］_i轻微升高，在0．4 mmol/L时的升钙作用最大(升钙百分率为12 ．20％±1．24％)。在测定介质中加入钙离子载体A₂₃₁₈₇(10 μmol／L)，使神经细 胞内的钙离子浓度升高，若此时加入牛磺酸(1．6mmol/L)，则神经细胞内钙离子的浓度下降 。结论：牛磺酸对细胞内钙离子有双向调节作用，牛磺酸可能是通过对钙稳 态的调节作用来阻止细胞内钙超载，保护神经细胞、并发挥其增强动物学习记忆等方面功能 的。

中图分类号：R961文献标识码：A文章编号：1000-6 834(2000)03-0193-05

EFFECT OF TAURINE ON CYTOSOLIC CALCIUM HOMEOSTASIS IN BRAIN NEURONS OF RATS

AN Wen-lin¹,WANG Hui-qin²,ZHANG Hong-wei²,SHEN Jia-qin², JING Xiang-hong³,LI Ri-wu³,LI Lin¹

(1.Beijing Geriatric Clinical & Research Center ,Capital Univers ity of Medical Sciences,Xuan-wu Hospital, Beijing 100053;2.Department of Nutrit ion & Food Hygiene,Capital University of Medical University Sciences,Beijing 1 00054;3.Institute of Acupuncture China Academy of traditional Chinese me dicine,Beijing 100700)

ABSTRACT

Aim and Methods:To investigate the effect of taurine on cytosolic free calcium (［Ca²⁺］_i),one of the second messengers in signal transduction ,in brain cells isolated neonatal rats detected by fluorespectrophotometer,and in the primary cultured single hippocampal cell detected by laser confocal micr oscope,respectively. Results:Taurine induced a rapid, dose-depe ndent increase in cytosolic calcium levels in suspension of neuronal cells,with the extracellular physiological Ca²⁺concentration.Taurine at the dose of 0.4 mmol/L exhi-bited its highest increase in cytosolic calcium(the increa se per centage of Ca²⁺was 12.20%±1.24%).When we added A₂₃₁₈₇,one of th e Ca²⁺ionophore,to normal calcium containing media,the single neuronal ce ll［Ca²⁺］_i was increased but it was decrease as soon as 1.6 mmol/ L ta urine was added.Conclusion: Cytosolic calcium homeostasis can be ad justed by taurine,and the slightly increase cytosolic calcium in neuronal cells may be one of the major mechanism of taurine’s enhancing the memory and learn ing ability.

KEY WORDS: taurine;neuronal cells;calcium;laser scan ning confocal microscope

牛磺酸是一种条件必需氨基酸，它在中枢神经系统中特异性地分布于大脑皮质、海马、 小脑等区域。近年来的研究表明，它与中枢神经系统正常生理功能的维持有密切关系。牛磺 酸能明显的促进大鼠的学习记忆能力，并具有保护细胞和延缓衰老的功能。牛磺酸的缺乏， 将导致一系列的病理生理改变。但牛磺酸在这方面的作用机理研究的却很少，本实验旨在研 究牛磺酸与神经细胞内钙稳态的关系，以探讨牛磺酸的增智抗衰机理。

1材料与方法

1．1试剂和仪器

Fura-2/AM(购自中国医学科学院药物研究所)；牛磺酸，Fluo-3/AM，F-127，牛血清 白蛋白，新霉素(neomycin) A₂₃₁₈₇和Dantrolene(Sigma公司产品)；尼莫地平(德国B ayer公司产品)；L-谷氨酸(L-Glutamic acid)，EGTA和TritonX-100(购自Serva公司) ；N3(购自军事医学科学院基础所)。

超净工作台，CO₂培养箱(美国SHELL／JB TC2323)，激光扫描共聚焦显微显微镜(美 国 Meri-dian公司，ACAS UVC575型)，双波长荧光分光光度计(日本岛津RF-5000型) 。

1．2通过双波长荧光分光光度计测定分散的脑神经细胞［Ca 2+］_i

参考Dildy及Leslie的方法^［1］，并略加改进。取新生(1～2 d)的Wistar大鼠, 开颅取全脑，分离出海马和皮层，用胰蛋白酶消化制成细胞悬液，用台盼蓝排斥反应实验检 查，细胞成活率达95％以上细胞悬液方可使用。上述细胞悬液在37℃水浴预温5 min后，加 入钙离子荧光探针Fura-2／AM(终浓度4 μmol/L)，37℃恒温振荡45～50 min，使 Fura- 2／AM负载入神经细胞。用测定液悬浮细胞并调节细胞密度至1～2×10⁶/L，置于冰浴中待 用。

利用岛津RF-5000型双波长荧光分光光度计进行荧光测定，测定参数：激发狭缝5 nm， 发射狭缝10 nm，激发波长345 nm和380 nm，发射波长为480 nm，响应因子0.02，激发波长 变换时间2 s。观察不同实验条件下荧光强度的变化，并计算出不同实验条件下神经细胞［C a²⁺］_i与相对于静息状态时的变化百分率。

1．3利用激光扫描共聚焦显微镜动态测定培养的单个海马神经 细胞［Ca²⁺］_i

将新生乳鼠的原代海马神经细胞用无血清培养液培养在35 mm培养皿中，当神经细胞培 养至8～11 d时，将钙离子荧光探针Fluo-3/AM(终浓度4 μmol／L)，使荧光探针负载入神 经细胞。用激光扫描共聚焦显微镜在E_λx=488 nm E_λm=530／30 nm条件下， 每隔10～20 s扫描1次，动态记录单个海马神经细胞［Ca²⁺］_i的荧光图象，并对神 经细胞内不同部位Ca²⁺浓度的变化进行分析。

1．4剂量及分组

用双波长荧光分光光度计测定单纯牛磺酸对神经细胞内钙离子作用时，分为细胞外有钙 组和无钙组，每组中又分为不同的牛磺酸剂量组(0．02 mmol/L, 0．1 mmol/L，0．4 mmol /L,1．6 mol/L和6．4mmol/L)。测定分散的大鼠脑神经细胞［Ca²⁺］_i时，设单纯 牛磺酸组(Tau)、尼莫地平组(Tau+nim)、dantrolene 组(Tau+Dan)和新霉素(Tau+neo)组。 其中后三组是在加入牛磺酸(0．4 mmol/L)前，预先分别用三种工具药(尼莫地平，dantro lene和新霉素)与神经细胞作用10 min，再开始测定，先观察细胞内基础钙离子的水平，再 加入牛磺酸测定其引起细胞内钙离子浓度变化的百分率。用激光扫描共聚焦显微镜测定时， 除了设以上三组外，还加用了钙离子载体A₂₃₁₈₇(在实验过程中加入)。

1．5数据处理

用双波长荧光分光光度计直接测得神经细胞内钙离子浓度，计算其在加药前后［Ca ²⁺］_i变化的百分率，并用SPSS软件包对各组的实验数据进行单因素方差分析。对激光 共聚焦显微镜采集到的单个细胞荧光图像的不同部位进行标记测量，观察其在加药前后细胞 内钙离子浓度的变化情况。

2结果

用双波长荧光分光光度计检测结果显示：当测定液中含有生理浓度的Ca²⁺(1．3 mmol/L)时，牛磺酸能使分散的新生大鼠脑神经细胞［Ca²⁺］_i升高；牛磺酸的浓度 为0．4 mmol/L时升Ca²⁺作用最明显(升钙百分率为12．20％±1．24％)，随着牛磺 酸浓度的进一步增加，其升钙作用逐渐减弱；在去除测定液中的Ca²⁺时，即在物细胞 外无钙的情况下，牛磺酸仍能使神经细胞［Ca²⁺］_i升高(图1)。

Fig.1 Effect of taurine on cytosolic free calcium of brai n neural cells of rats with/without extracellular Ca²⁺(±s)

为了进一步探讨牛磺酸升钙作用的机理，选择了三种工具药进行实验。在测定液中预先 加入钙通道阻断剂一尼莫地平(终浓度10 μmol/L)^［2］，并不能抑制牛磺酸的升钙 作用。在测定液中预先加入Dantrolene(终浓度 50 μmol/L)，阻止Ca²⁺从细胞内钙 库释放^［3］，则牛磺酸的升钙作用明显减弱。 在测定液中预先加入磷脂酰肌醇-4 ，5-双磷酸(phosphatidyl inositol biphosphate，PIP2)的整合剂-新霉素(10 mmol/L) ，使三磷酸肌醇(inositol-1，4，5-triphosphate，IP₃)合成减少，则牛磺酸的升钙作 用亦被抑制(图2)。

Fig.2 Mechanism of t