摘要 目的：观察糖尿病时红细胞的粘附，探讨红细胞粘附对糖尿病微血管病变的影响 。方法：STZ诱发大鼠糖尿病，FITC体外标记糖尿病红细胞后输给正常大鼠，荧 光显微镜观察标记的糖尿病红细胞在正常大鼠软脑膜微血管中的流动；透射电镜观察糖尿病 大鼠脑皮质微血管内红细胞的超微结构。结果：与正常红细胞相比，FITC标记的 糖尿病红细胞在血流正常的大鼠脑微血管中可以较长时间停留在内皮细胞表面，不被血流冲 走，提示红细胞对微血管内皮细胞有粘附；电镜显示，糖尿病大鼠红细胞常常塞满毛细血管 腔，红细胞膜与内皮细胞膜紧密相贴，其间缺乏应有的血浆层间隙，并可见高电子密度的结 节状结构。可能是红细胞的“粘附结节”。结论：糖尿病大鼠红细胞对脑微血管 内皮细胞有粘附并首次观察到糖尿病时在脑微血管中红细胞的“粘附结节”。

中图分类号：R587.1;R311.1⁺41文献标识码：A文章编号：1000-6834 （2000）03-0260-05

RESEARCH ON THE ADHESION OF ERYTHROCYTES IN STZ-INDUCED DIABETIC RATS

ZHENG Shi-rong, TIAN Niu

(Microcirculation Laboratory,General Hospital of PLA. Beijing 100 853)

ABSTRACT

Aim: To investigate the adhesion of erythrocyte to endothelial cells and their influence on the development of microangiopathy in diabetes. Meth ods: Diabetes in rats were induced by STZ. Erythrocytes were isolated an d labeled with FITC, then transfused to normal rats. The movement of FITC labele d-RBC within microvessels were observed on pial mater under intravital fluoresc ent microscope. The ultrastructure of erythrocytes in brain of diabetic rats we re observed by transmission electron microscope. Results: FITC-labe led diabetic erythrocytes were found stopping at capillary for longer time, and sticking to the surface of endothelial cells at local microvessels even though t he blood stream were rapid. Ultrastructural study of erythrocytes in cerebral m icrovessels of diabetic rats showed that the tiny thin plasma layer between eryt hrocytes and endothelial cell was absent, and nodular structure with high electr on density were revealed. Conclusion: It showed that the adhesion of diabetic erythrocytes to endothelial cells both in vivo and in ultrastructural level,“adhesion nodule”was revealed at the first time in diabetic erythrocytes within rat cerebral microvessels.

KEY WORDS: diabetes milites；erythrocytes;ultrastruc ture；adhesion;endothelial cells;FITC

红细胞(RBC)是血液中极其重要的细胞成分，糖尿病时红细胞可与血管内皮细胞(EC)粘 附，RBC对EC的粘附增强与糖尿病血管并发症严重程度有关^［1］。近年来，陆续有研 究报道利用分离的糖尿病人红细胞与培养的血管内皮细胞研究糖尿病的红细胞粘附及其对血 管并发症的影响^［2～6］，但从方法上看多为体外实验，缺少在体对糖尿病时红细胞 与内皮细胞粘附的观察报告。在体内，探讨糖尿病时红细胞在微血管内“自然”状态、红细 胞与内皮细胞的粘附有那些表现形式,有助于加深对糖尿病红细胞粘附及其病理意义的认识 。为此，我们利用链尿佐菌素(streptozotocin，STZ)诱发糖尿病大鼠，在活体上观察了荧 光标记的红细跑对脑微血管的粘附，通过透射电镜观察了脑微血管中红细胞粘附的超微结构 ，获得了一些新认识。

1材料与方法

1．1糖尿病动物模型复制

采用健康、雄性的 Wistar大鼠(体重180～230 g)，随机分组，通过尾静脉一次性注入 STZ(50 mg／kg，Sigma)诱发大鼠糖尿病。第一周血糖超过16．6 mmol/L的大鼠即为糖尿 病大鼠，我们选择病程4个月以上的糖尿病大鼠供实验观察，对照为同期饲养的正常大鼠。

1．2红细胞的分离和荧光标记

用乙醚麻醉大鼠，抽取心血3 ml，肝素抗凝，离心，弃血浆及白细胞层，用PBS反复洗 涤离心，获得洗涤红细胞。将洗涤红细胞(细胞压积为90％)与0．067％异硫氰酸荧光黄(FIT C，Sigma)溶液共同孵育^［7］，4℃过夜：用PBS反复洗涤并离心标记后的红细胞，直 至上清液中无FITC，获得可输注的荧光标记红细胞(FITC-RBC)。分别分离、标记糖尿病1年 大鼠和同期对照大鼠红细胞，各3只。

1．3荧光标记红细胞在微血管中流动的活体现察

取体重200～250 g的正常大鼠，乌拉坦麻醉，脑顶部矢状缝旁开颅窗，在显微镜下找到 血管分布走行清晰、无微血管损伤、无出血的软脑膜微循环观察部位，作好标示。取下大鼠 ，心脏穿刺输注0．5 ml FITC-RBC，迅速放回荧光显微镜下，观察荧光标记红细胞在软脑 膜微血管中的流动、粘附情况，利用真彩色通用医学图象分析系统对图象进行回放分析。

1．4脑组织电镜标本取材及观察

大鼠麻醉后在脑顶部矢状缝旁开颅窗，经颅窗挖取脑皮质组织(2 mm³)，戊二醛固定 ，常规电镜切片，透射电镜(H-7000、Hitachi)观察并照相。本组实验观察14只大鼠脑切片 ：糖尿病4个月大鼠4只、1年大鼠3只；同期对照大鼠7只。

2结果

2．1糖尿病大鼠的一般变化

注射STZ后两天内大鼠即出现多饮，多食，多尿，体重减轻，病程中持续高血糖，尿糖 阳性，两个月后大鼠出现白内障，三个月时出现蛋白尿(24 h尿蛋白定量0．200±0．086 g ／24h，n=10)，肾脏和脑均已出现微血管组织病理学改变，上述结果证明实验模型可靠 。

2．2标记红细胞的涂片观察

在荧光显微镜下，FITC标记的 RBC呈双凹形的圆盘状，表面呈现黄绿色荧光，大小和形 状与标记前比较无明显变化(图1)。

Fig．1 Diabetic erythrocytes，labeled wit h FITC

2．3软脑膜微血管中标记红细胞流动的观察

正常大鼠心内注射FITC-RBC后即刻，软脑膜微血管中能观察到FITC-RBC，2～5 min后标记红细胞己在细动脉、细静脉中分布均匀，在管径范围20～80 μm的微血管中，标 记红细胞呈流线状随血流迅速流过，流速范围在80～250 μm／s。在3～10 μm管径的毛细 血管内标记红细胞常以单个细胞从血管中挤过，流速在40～100 μm／s左右。正常大鼠 FIT C-RBC在细动脉、细静脉血管中很少停留，在毛细血管中短暂停留，红细胞与血管壁接触时 间一般在0～30 s以内。糖尿病大鼠FITC-RBC在毛细血管中停留时间可长达60 s以上。在20 倍物镜的视野内，接受正常红细胞的大鼠平均见有3～5个停滞红细胞，而接受糖尿病红细胞 的大鼠可见十个以上停滞红细胞。在血流速度较快(流速在160 μm／s左右)的细静脉血管中 ，有FITC-RBC停留在血管内表面，停留时间大于10 s，以后又被血流冲走，显示糖尿病红 细胞对血管内皮细胞的粘附(图2)。

Fig．2 Movement of fITC-labeled diabetic RB Cs within Cerebral microvessels in normal rats

A．Flowing of FITC-labeled diabetic RBCs in venule； B．Sticking of FITC-labeled diabetic RBCs to the vessel wall; C．Sticking of labeled diabetic

RBCs to vessel wall for more than 10 second and flowing again

2．4微血管中红细胞超微结构的变化

正常大鼠，毛细血管中红细胞膜结构完整、清晰，血红蛋白密度均一，被包饶在膜内， 红细胞与血管壁内皮细胞之间可见明确的血浆层间隙(图3)。在病程4个月到1年的糖尿病大 鼠脑微血管内，红细胞变化都十分明显。在可见红细胞的毛细血管管腔内，红细胞常常塞满 管腔并与内皮细胞紧贴，红细胞膜与内皮细胞膜之间缺乏应有的血浆间隙，显示红细胞对微 血管壁的贴附。糖尿病4个月大鼠的脑微血管内，在紧贴的红细胞与内皮细胞膜之间，观察 到高电子致密度的结节状结构，锚定红细胞和内皮细胞，红细胞其余胞体在血流方向上发 生形变(图4)。

Fig.3 Erythrocyes within cerebral micr ovessels in controled rats

Erythrocyte with well defined membrane structure,a definite thin lay er of plasma between RBC and EC was present even if the vessel was full of the erythrocyte(×10 000)