摘要 目的：研究大鼠中度侧位液压冲击脑损伤时脑干c-fos mRNA及其表达产物Fos变 化规律。方法：雄性SD大鼠，随机分为正常对照组、手术对照组和损伤组 。损伤组动物均给以0.2 MPa液压冲击脑损伤，按冲击后处死时间不同再分为5 min、15 min 、30 min、1 h、2h、4h、8 h和12 h组。应用免疫组织化学和原位杂交方法观察c-fos 在脑干的表达。结果：脑冲击后15 min～12 h,Fos阳性细胞数逐渐增多，12 h达高峰。冲击后5 min，c-fos mRNA表达开始增强，1～2 h达高峰。结论：侧位液压冲击脑损伤后c-fos在脑干表达迅速增强，持续时间较长。

中图分类号： R651．1^＋5；Q786文献标识码：A文章编号：1000-6834(2000)03-0214-04

EXPRESSION OF c-fos IN BRAIN STEM FOLLOWING MODERATE LATERAL FLUID PERCUSSION BRAIN INJURY IN RATS

ZHANG Yong-liang¹,LI Ling-zhi¹,LIU Min²,LIAO Zhi-gang²,WANG Bing-kang²,WU Jia-wen²,WU Mei-yun²

(2.College of Forensic Medicine,West China University of Medical Sciences,Chengdu 610041; 1.Medical College of Chinese People’s Armed Police Forces,Tianjin 300162)

ABSTRACT

Aim:To study the expression of c-fos in brain stem following moderate l ateral fluid percussion brain injury in rats,and to observe the temporal pattern s of its expressions following percussion.Methods:Male Sprague- Dawley rats were divided into normal control,sham operation control and injury g roups. The rats of injury groups subjected to moderate lateral fluid percussion injury(0.2 MPa),and then were subdivided into 5 min,15 min,30 min,1 h,2 h,4 h ,8 h,and 12 h groups according to the time elapsed after injury.The expression o f c-fos was studied by immunohistochemistry and in situ hybridization.Results:After percussion for 15 min,Fos positive neurons increased in brain stem progressively,and peaked at 12 h.At 5 min after percussion,the induc tion of c-fos mRNA was increased,and remained elevated up to 1～2 h after br ai n injury. Conclusion:The induction and expression of the c-fos in brain stem after fluid percussion brain injury were increased rapidly and lasted for a long time.

KEY WORDS:c-fos;immunohistochemistry;in situ hybridization;brain injury;rat

研究发现c-fos基因是神经细胞最常见的立即早期基因之一，正常时有低水平表达，参 与细胞生长、发育、分化和信息传递等生理功能，神经系统的许多疾病，如癫痫、脑缺血及 机械性脑损伤等，均可引起表达增强^［1］。已有学者对脑损伤时c-fos的表达进行 了研究，但迄今未见有关脑损伤时脑干c-fos表达的研究报道^［2～6］。

本文选择大鼠中度(0.2 MPa)侧位液压冲击脑损伤模型，采用免疫组织化学和分子原位 杂交技术，对脑损伤后脑干c-fos mRNA表达的时序性变化进行了定位和半定量观察，为进 一步研究闭合性颅脑损伤时脑干损伤的分子机制提供理论基础。

1材料与方法

1.1动物及分组

雄性SD大鼠30只，体重350～420 g，由四川抗生素研究所实验动物中心提供。随机分为正常 对照组、手术对照组及损伤组，前两组各3只，损伤组24只。损伤组按冲击后处死时间不同 又分为5 min、15 min、30 min、1 h、2h、4h、8h、12h等8个亚组，每组3只大鼠。

1.2动物实验及组织处理

损伤组动物均按0．2 MPa的冲击力造成中度侧位液压冲击脑损伤。在冲击后不同时间经2％ 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，于主动脉灌注4％多聚甲醛固定液(pH 7．4)处死。取脑干，在 4％多聚甲醛固定液(pH 7．4)中后固定12h(4 ℃)。于脑干正中作矢状切面，左侧留作原 位杂交，右侧留作H．E和免疫组织化学染色。

用于H．E和免疫组化染色的组织块经石蜡包埋、切片(厚5 μm)。用于原位杂交的组织 块于4℃经30％蔗糖(4％多聚甲醛固定液配制，pH 7．4)脱水后，在恒冷切片机切片，温度 为-18℃，切片厚20μm。

手术对照组动物仅行颅骨钻孔及固定螺母，于术后24 h麻醉后处死，处死方法、后固定、取 材及后处理同损伤组。

正常对照组动物处死、取材及后处理同损伤组。

实验中动物直肠温度保持在（38±1）℃。

1．3仪器

低温高速离心机(Hermle)：DU-600紫外分光光度仪(Beckman)；恒冷切片机(Bright) ；THW-500型真彩色图像分析系统(四川联合大学图像研究所)。

1．4试剂

1．4．1免疫组织化学试剂 兔抗人c-fos多克隆抗体(Santa Cruz，Cat．No．sc52)：兔SP^TM试剂盒(Zyme d，Cat．No．CH95-7101)含生物素化羊抗兔IgG及SP复合物；DAB(DAKO)。

1．4．2原位杂交试剂 地高辛DNA标记和检测试剂盒(Boehringer Mannheim，Cat．No．1093657)，含羊抗地高辛抗体、硝基蓝四氮唑(NBT)、5-溴-4-氯-3吲哚磷酸(BCIP)；c-fos cDNA探针(1．3 Kb，中山公司，Cat．No．ZDP7004)。

1．5方法

1．5．1免疫组织化学染色法 兔抗人c-fos及羊抗兔IgG工作浓度均为1∶200，DAB显色。阳性对照为人结肠癌癌旁 组织，棕黄色颗粒主要位于细胞核，细胞浆为弱阳性；阴性对照用PBS代替一抗，其余步骤 相同，细胞内无棕黄色颗粒。在图像分析系统下对脑干中缝核免疫反应阳性细胞进行计数( 观察窗面积：100 μm²)，求出该面积阳性细胞数(N)及其阳性细胞面积(A)，显微镜放大 倍数为400倍。

1．5．2原位杂交 用地高辛随机引物法标记探针，按试剂盒说明操作。杂交液探针浓度为0．5 μg/ml，4 5℃，杂交24 h,NBT／BCIP显色。

阴性对照为杂交液中不含探针，其余步骤相同。在图像分析系统下测定脑干中缝核阳性 神经细胞的灰度(GL)，显微镜放大倍数为400倍。

1．6统计分析

采用华西医科大学卫生统计学教研室 PEMS统计软件进行统计分析，统计方法为方差分 析及q检验。

2结果

2．1H．E染色病理组织学改变

损伤后30 min，脑干部分神经细胞胞体固缩、深染、拉长或呈三角形，细胞核小而深 染，树突深染、呈波浪形。损伤后60～120 min，脑干水肿，4 h以后，部分神经纤维增粗、 呈波浪状改变。

正常对照组及手术对照组未见明显改变。

2．2Fos免疫组织化学染色结果

对照组脑干部分神经细胞呈Fos阳性，阳性物质主要位于细胞核内，细胞浆呈弱阳性(图 1)。冲击后15 min～12 h，Fos阳性细胞数逐渐增多，12 h达高峰(图2)。与对照组比较，1 5 min～4 h组，P＜0．05，8 h和12 h组，P＜0.01；Fos阳性细胞面积随阳性细胞数 增多而逐渐增加，冲击后1～12 h比对照组明显增大(P＜0．01，图3)。

Fig.1 There were a few Fos pos itive neurons of brain stem in control, the positive substances located in nucle i was stained strongly,and weakly in cytoplasm(×400)

Fig.2 Increasing Fos positive n eurons of brain stem at 1h after percussion(×400)

Fig.3 Time course of the number(N) and area(A) of FOS protein positive neurons in brain stem after fluid percussion br ain injury

^*P＜0.05,^**P＜0.01 com pared with control

Fig.4 c-fos mRNA of brain ste m was expressed weakly in control(×400)

2．3c-fos原位杂交结果

原位杂交阳性物位于神经细胞脑浆内，细胞核内未见表达。对照组脑干神经细胞有弱阳 性表达，可以辨认神经核团(图4)。冲击后5 min，表达开始增强，1h达高峰。5min～4 h 与对照组比较有显著性差异(P＜0．01)，8 h