摘要 目的和方法：将红细胞生成素(EPO)3′-增 强子野生片断及点突变片断借脂质体转入人脐静脉内皮细胞株ECV-304，用半定量RT-PCR 测 定正常与缺氧诱导因子-1(HIF-1)诱导剂氯化钴(CoCl₂)作用下培养6 h的细胞环氧合酶 -2(COX-2)和血栓素合酶(TXS)的mRNA。结果：HIF-1诱导剂CoCl₂可诱导ECV -304的COX-2和TXS基因转录明显增强；向细胞导入野生EPO3′增强子片断可阻断CoCl₂ 诱导的COX-2和TXS基因转录增强，而点突变片断无此作用。结论：在COX-2和T XS基因序列中，可能存在EPO3′-增强子类似片断中的HIF-1的结合序列，HIF-1诱导COX -2和TXS基因表达增强可能主要通过HIF-1与该序列结合实现的。

中图分类号：Q58；R594.3文献标识码：A 文章编号：1000-6834(2000)01-0048-04

HYPOXIA-INDUCIBLE FACTOR 1 AND ERYTHROPOIETIN 3′-ENHANCER REGULATE GENE TRANSCRIPTION OF CYCLOOXYGENASE AND THROMBOXANE SYNTHASE IN ENDOTHELIAL CELLS

XIA Ruo-han,HAO Tian-ling,YU Jiang-zhou,JIN Xian-rong

(Departement of Pathophysiology,Tongji Medical University,Wuhan 4 30030)

ABSTRACT

Aim and Methods:Wild or spot mutant of erythropoietin(EPO)3′-enhancer fragments were synthesized in vitro and transfected into cultured human umbilica l vein endothelial cell line ECV-304.Total RNA was extracted from ECV-304 cell s exposed to normal or cobalt chloride, an inducer of hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1), for 6 hours. COX-2 and TXS mRNA were measured by semiquantitation R T-PCR. Results:COX-2 and TXS mRNAs were increased in ECV-304 cell s exposed to CoCl₂.which could be inhibited by the transfection of the wild EP O 3′-enhancer fragment but not by the mutant one. Conclusion:It is suggested that the COX-2 and TXS gene might contain sequences similar to the HI F-1 binding site in the EPO 3′-enhancer, which in combination with hypoxia- induced factor-1 might contribute to the increase of COX-2 and TXS mRNA induce d by CoCl₂.

KEY WORDS： hypoxia-inducible factor 1; Erythropo ietin 3′-enhancer;cyclooxygenase-2;thromboxane synthase;gene transcript ion

缺氧是许多疾病发病过程中一个最重要的病理因素，近年发现缺氧过程中可能存在共同的信 号传导系统；细胞缺氧时，HIF-1这种核蛋白的DNA结合活性被激活，结合类似EPO 3′-增 强子序列中5′-TACGTGCT-3′，而启动含该序列的基因^［1，2］。我室已发现血管 内皮生长因子和环氧合酶缺氧信号传导与EPO 3′-增强类似序列密切关联^［3］。本 课题主要研究HIF-1诱导剂CoCl₂对人脐静脉内皮细胞株ECV-304的COX-2和TXS基因转录 的影响及EPO 3′-增强子在其中的作用。

1材料与方法

1.1EC-304细胞的培养

EC-304细胞用含20%小牛血清的M199培养液置于37℃、5%CO₂培养箱内贴壁培养，待长满 培养面后用PBS冲洗2次，加入0.25%胰蛋白酶消化，传代。

1.2合成有关DNA片断

(1)根据EPO基因序列合成EPO 3′-增强子野生型和点突变型片断^［3］；

野生型片断：5′-agcttGCCCTACGTGCTGTCTC

Ag3′

3′-aCGGGATGCACGACAGAGTcttaa-5′

突变型片断：5′-agcttGCCCTAAAAGCTGTCT

CAg-3′

3′-aCGGGATTTTCGACAGAGTcttaa-5′

(2)根据COX-2^［4］TXS^［5］和β-actin基因DNA序列合成COX-2、TXS PCR 引物和内标β-actin PCR引物：

COX-2引物：5′-ACTTGCTCACTTTGTTGAG

TCATTC-3′

5′-TTTGATTAGTACTGTAGGGTTAATG-3′

扩增产物片断长583bp。

TXS引物：5′-ATTGCAGAGACGCTGAGGAT-3

5′-AGCATTTAGGAAATGTTATGTAA-3

扩增产物片断长547bp。

β-actin引物：5′-CACACCTTCTACAATGAGC

TGCG-3′

5′-CTGCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′

扩增产物片断长1036bp。

1.3实验分组

(1)正常对照组融合细胞用MI99无血清培养同步化6 h，培养6 h。

(2)CoCl₂诱导HIF-1组融合细胞用MI99无血清培养同步化6 h,200 μ M CoCl₂下培养 6 h。

(3)导入野生型BPO 3′-增强子片断+CoCl₂组野生型EPO 3′-增强子片断转入内皮细 胞并用MI99无血清培养基同步化6 h,200 μ M CoCl₂下培养6 h。

(4)导入突变型EPO 3′-增强子片断+CoCl₂组突变型EPO 3′-增强子片断转入内皮细 胞并用MI99无血清培养基同步化6 h,200 μ M CoCl₂下培养6 h。

1.4脂质体介导DNA片断转染内皮细胞

在无菌条件下将6 μg人工合成的EPO 3′-增强子DNA片断和10 μl Iipofectin试剂分别溶 于100 μl和99 μl无血清培养基中，再将两溶液轻轻混合，置室温15 min。洗去细胞培养 液，加0.8 ml无血清培养基至Lipofectin-DNA混合物中，混合后小心滴加至细胞上，37℃ 5% CO₂培养箱培养6 h，原位杂交鉴定EPO 3′-增强子片段是否转入内皮细胞。

1.5RT-PCR

用TRIZON试剂提取总RNA，取2 μl紫外分光测定OD260/280定纯度和量；5 μl进行1%甲醛变 性凝胶电泳鉴定其完整性。取RNA2 μg,用oligo(dT)12-18作引物，Super Script TⅡ逆转 录酶42℃进行逆转录50 min。取逆转录产物4 μl做PCR扩增COX-2和TXS，94℃ 1 min,55℃ 1 min,72℃ 1.5 min，共35个循环，最后72℃延伸10 min。

1.6PCR产物测定

取PCR产物6 μl，2%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯照相，以条带大小及深浅判定COX-2和TXS mRNA的水平，并经图像分析处理。以平均光密度乘以条带面积表示总的光密度(OD)代表 mRN A量。

2结果

2.1RNA纯度、完整性鉴定

测得OD260/280比值均大于1.9，电泳可见清晰的18S，28S条带(图1)

Fig.1 RNA electrophoresed.lane l:normal;lane 2:CoCl₂;lane 3:CoCl₂+wild fragment:lane 4:CoCl₂+mutant fragm ent

2.2原位杂交结果

转染EPO 3′增强子野生型片断与未转染相比，可见胞浆和胞核有蓝色阳性颗粒，胞浆多见( 图2)。说明外源 合成的EPO 3′-增强子野生型片断经脂质体介导大量转入细胞内。

Fig.2 Results of hybridization in situ. A:negative contrast; B:transfected wild EPO 3′enhancer fragment

2.3PCR结果

正常对照组，CoCl₂组，转染EPO 3′-增强子片断组和转染突变组扩增β-actin带OD值 均无显著性差异，说明β-actin基因表达不受上述条件的影响；CoCl₂组COX-2和TXS值 明显高于正常对照组（P＜0.01)，转染EPO 3′-增强子片断+CoCl₂组COX-2和TXS带 OS值明显低于CoCl₂组(P＜0.01)，而与正常对照组差异无显著性（P＞0.05)，转染 突变片断+CoCl₂组COX-2和TXS带OD值与CoCl₂组差异无显著性（P＞0.05)，(图3)。 结果说明：CoCl₂可诱导COX-2和TXS基因表达增强，向细胞导入EPO 3′-增强子片断可 阻断CoCl₂的这种效应。

Fig.3 Effects of COX-2 and TX A₂ mRNA on CoCl₂ and transfected EPO 3′-enhancer fragments.M:PCR Marker;A: normal:B:CoCl₂;C:transfected EPO 3′-enhancer wild fragment+CoCl₂;D:transfe cted EPO 3′-enhancer mutant fragment+CoCl₂

3讨论<