摘要 目的：探讨睫状神经营养因子（CNTF）对骨骼肌细胞的直接营养作用，从而 为神经肌肉系统损伤和退行性病变的治疗提供新的思路。结果：CNTF可以促进 体外培养的L6-TG肌母细胞和新生SD大鼠原代骨骼肌细胞增殖。结论:CNTF对体 外骨骼肌细胞具有营养作用。CNTF的神经和肌肉双重营养性能使其可能在神经肌肉损伤和退 行性病变的治疗上发挥重要作用。

中图分类号：Q78文献标识码：A文 章编号：1000-6834（2000）01-0059-05

ENHANCING EFFECT OF CNTF ON THE PROLIFERATION OF SKELETAL MUSCLE CELLS IN CULTURE

DENG Xiao-hua¹, SHI Jian², JIANG Chun-lei², LU Chang-lin

(2.Department of Neurobiology, Department of Basic Medicine. Seco nd Military htedical Mniversity,Shanghai, 200433)

ABSTRACT

Aim： To study the direct trophic function of CNTF on muscle, and to exp lor new methods for nerve-muscle injury and retrogression.Results:CNTF can enhance the proliferation of L6-TG cells and newborn SD rat primary sk eletal muscle cells in culture.Conclusion:CNTF is of trophic functio n on muscle cells in culture. The neurotrophic and myotrophic effect of CNTF ma y play an important role in the treatment of nerve-muscle injury and retrogress ion.

KEY WORDS: cilliary neurotrophic factor(CNTF);skele tal muscle cells；proliferation

神经肌肉疾病是神经系统的常见病，其病因和发病机理十分复杂，如遗传缺陷、发育异常、 代谢紊乱、自身免疫、中毒、外伤、炎症等均可造成神经肌肉疾病。目前对神经肌肉疾病的 研究，已成为神经科学最活跃的研究领域之一，人们致力于寻求有效的防治方法。神经肌肉 疾病是累及肌肉、运动神经元、周围神经和神经肌肉接头的疾病，目前尚无很好的治疗方法 ，对此病的治疗应该针对上述几个环节进行。

睫状神经营养因子(cilliary neurotrophie factor CNTF)是从鸡胚睫状神经节中提取的一 种 神经营养活性蛋白。它由200个氨基酸组成，广泛分布于神经系统，具备多种生物学功能： 如促进前体神经元生长、分化和成熟，维持各种神经元存活，促进损伤神经元再生修复，阻 止神经元退行性变，保护神经胶质细胞等^［3］。近几年研究发现CNTF对肌肉也有营 养作用(Broohes，1993)，CNTF和脑源性神经营养因子(BDNF)联合使用可改善wobbler小鼠的 肢残程度并能增加肌张力(Hiroshi，1964)；许多证据提示，CNTF可能是一种神经源性的肌 肉营养因子。本实验观察CNTF对体外培养L6-TG肌母细胞和新生SD大鼠原代骨路肌细胞增殖 的影响，以探讨CNTF对骨路肌细胞的直接营养作用，从而为神经肌肉系统损伤和退行性病变 的治疗提供新的思路。

1材料和方法

1．1器材与试剂

CNTF和神经营养因子(NGF)(第二军医大学神经生物教研室提供)；L6-TG大鼠肌母细胞 株(中科院上海细胞所 )；新生SD大鼠(上海马普尔-必凯实验动物中心)；RPMI1640和DMEM培养基、胰岛素、胰蛋 白酶(1：250)和阿糖胞苷(Sigma)；新生牛血清(杭州四季青生物试剂公司)；胎牛血清和马 血 清(Gibco)；结晶紫(上海生化试剂公司)；35 mm培养皿、96孔细胞培养板(Nune公司)；酶联 检测仪(BIO-RAD)。

1．2细胞培养

取一管冻存的大鼠L6-TG肌母细胞用含10％新生牛血清的RPMl 1640培养液常规培养，2 ～3 d换液，当细胞基本铺满瓶底时传代或冻存。新生SD大鼠骨骼肌原代细胞采用文献 ［2，3］所述 方法培养，当细胞接近形成单层时0．1％胰蛋白酶消化传代。

1．3加样

当细胞接近形成单层时，用0．1％胰蛋白酶消化，制成细胞悬液，按每孔2×10⁴/ ml(骨骼肌原代细胞)或8×10⁴/ml(L6-TG细胞)左右的密度传代至96孔细胞培养板，每 孔100 μ l，既每孔2 000或8 000个左右细胞，留一行不加细胞(作空白对照)，置于5％CO²、37 ℃孵箱培养，第2 d加样。每块96孔板设一空白对照组、一阴性对照组和各实验组，以一行 为一组，每组8个样本，一块96孔板可分12组。空白对照组无细胞，仅加培养液100μl／ 孔；阴性对照组有细胞，加培养液100 μl／孔；实验组加入培养液l00 μl／孔，L-6T G细胞初始加入CNTF25 μg/ml,然后倍比稀释8次；原代骨路肌细胞初始加入CNTF16 μ g/ml,然后倍比稀释8次：两种细胞加入NGF的初始浓度均为15 μg/ml。

1．4结晶紫染色测定细胞数

加样后24h，弃去孔中培养液，用0．01mmol/LPBS(pH7．2)洗2次×5min，每 孔加0．5％结晶紫100μl，室温放置15min，弃去结晶紫，同样PBS洗3次×5 min，然后 每孔加10％SDS100μl，置37℃，30min后用酶联检测仪测定490nm光密度值(O．D． )。

1．5数据处理

均数±标准误(±s)表示彩配对t检验确定差异的显著性。

2结果

2．1L6-TG肌母细胞细胞密度的形态学观察

对照组L6-TG肌母细胞排列稀疏(图1-a)，而CNTF组(浓度大于1.5 μg/ml)细胞明显 比对照组细胞密集，且细胞密度随 CNTF组浓度增大而增加(图1-b～e)，当CNTF组浓度 为25μg/ml时，细胞相互重叠(图1-e)。

O．D．值越大，表明细胞数量越多（图2-a）：当CNTF浓度小于0．1 μg/ml时，L6- TG肌母细胞数量与对照组相比无差别;在0．1～0.8 μg/ml范围内，L6-TG肌母细胞数量有 所增加，但无统计学意义；当达到0．8 μg/ml以上时,L6-T6肌母细胞明显增多(P＜0． 01)。并且CNTF浓度的对数值和L6-TG肌母细胞数量之间呈直线相关(图2-b)，表明CNTF促 进L6-TG肌母细胞增殖的作用具有浓度依赖性。

Fig.1 Effect of CNTF on the den se of L6-TG cells in culture.a,control group;b～e,CNTF groups,concentration of CNT F increased in b,c,d and e order (3.3×20)

Fig.2 Effect of CNTF on the pro liferation of L6-TG cells(n=12). a,cell quantity;b,correlation between conc entration of CNTF and O.D.value **P＜0.01,vs control

2．3新生SD大鼠原代骨骼肌细胞的形态学观察

在体外培养条件下，肌细胞分散后呈单个圆形，3～6 h内贴壁，24 h后形成单核梭形双 极或三角形成肌细胞(图3-a)。此时，成纤维细胞或其他非肌源性细胞增生活跃，加入阿糖 胞苷后抑制了它们的进一步增殖。3 d后成肌细胞因有丝分裂而大量增殖，一周左右形成单 层。当成肌细胞彼此接触，发生融合(图3-b)，形成宽大的多核长圆柱状肌管(图3-c)。当 骨路肌细胞接近形成单层时，胰酶消化传代至96孔板，加样24 h后观察，可见细胞密度CNTF 组(图4-b)明显大于对照组(图4-a)，且随CNTF浓度增加细胞密度也增大(图4-b～e)。

Fig．3 Newborn SD rat primary skeleta l muscle cells.a,spindle or triangle shaped mononuclear myoblasts；b，confusing myoblasts；c，multinuclear myotube．(3．3×40)

Fig.4 Effect of CNTF on the de nsity of newborn SD rat skeletal musclecellsin culture.a，control group; b～e，C NTF groups，concentration of CNTF increased in b，c，d and e order．(3．3×20)

Fig.5 Effect of CNTF on the pro liferation of newborn SD rat skeletal muscle cells in culture(n=12). a,cell quantity;b,correlation between concentration of CNTF and O.D.value

^**P＜0.01 vs control

Fig.6 Effect of NGF on L6-TG c ells and skeletal muscle of newborn SD rat in culture(n=12)

2．4新生SD大鼠原代<