摘要 目的：研究多巴胺对血管平滑肌细胞大电流、钙激活钾(BKca)通道的影响及其信息传递机制。方法：用膜片钳细胞贴附式技术，记录细胞孵育液内灌流多巴胺受 体激动剂、阻断剂以及第二信使及相关蛋白激酶拮抗剂对猪冠状动脉血管平滑肌细胞BKca通 道活动的影响。结果：多巴胺增加BKca通道活性(P＜0．01)；并可被DA-1 受体阻断剂SCH23390完全阻断，但不受β₂受体阻断剂普萘洛尔的影响。腺苷酸环化酶抑 制剂SQ22536可完全阻断多巴胺的作用；而cAMP拟似剂CTP-cAMP单独应用可增强BK_Ca 通道的活性。蛋白激酶A的拮抗剂 RP-8CTP-cAMPs对多巴胺增强BK_Ca活性作用无影 响。而蛋白激酶G的拮抗剂KT5823完全阻断了多巴胺这一效应(P＜0．01)。结论：多巴胺作用于DA-1受体增强猪冠状动脉血管平滑肌的BK_Ca活性是通过升高cAMP激活PKG引 起的。

中图分类号：Q424；Q463文献标识码:A文 章编号:1000-6834(2000)01-0033-04

THE ACTIVATION OF BK_Ca CHANNEL IN PORCINE CORONARY VASCULAR SMOOTH MUSCLE CELLS INDUCED BY DOPAMINE AND ITS SIGNAL TRANSDUCTION

HAN Gui-chun¹, Richard E.White²

(1.Dalian Medical University, Dalian 116027, 2.Wright State University Sch ool of Medicine,Dayton,Ohio 45435,U.S.A.)

ABSTRACT

Aim:To study the effects of dopamine on the large-conductance, calcium- and voltage- activated potassium (BK_Ca) channel in porcine coronary va scular smooth muscle cells and the mechanism of the signal transduction process. Methods:With patch-clamp technique,in cell attached patches, the a ctivity of the BK_Ca channel in porcine coronary vascular smooth muscle cel ls were recorded,after pre-treating the cells with the agonists and antagonists of DA-1 receptor, β₂-receptor,cAMP,PKA or PKG respectively.Results:Treating coronary myocytes with dopamine enhanced channel activity(P＜0.0 1),which was completely prevented by pretreating the cells with SCH23390,but not by proprandol.The activity of BK_Ca channels induced by dopamine was blo cked by SQ22536,and application of CPT-cyclic AMP increased channel activity su bstantially. Exposure of cells to RP-8CPT-cAMPs had no effect on dopamine-ind uced channel activity, in another set of cell-attached experiments the stimul atory effect of dopamine was reversed by subsequent addition of KT5823. Co nclusion: Activation of DA-1 receptors by dopamine causes stimulation of BK_Ca channel which is dependent upon cyclic AMP-induced activation of PKG and not PKA.

KEY WORDS: dopamine; vascular smooth muscle c ell; calcium-activated potassium channel;DA-1 receptor

近年来，多巴胺及其拟似剂作为有效的治疗充血性心力衰竭（CHF）药物己受到广泛 的关注^［1］。小剂量的多巴胺刺激血管平滑肌上的DA-1受体，升高 cAMP水平，引 起血管舒张^［2］,然而，继 cAMP以后的信息传递机制尚无人报道。血管平滑肌细胞 膜K⁺通道的开放及K^＋外流，使细胞膜复极化，从而关闭电位依赖性的Ca²⁺通道 降低血管平滑肌的紧张性。BK_Ca通道是血管平滑肌上4种类型钾通道中分布最密，起 主要作用的通道^［3］。另有报道，多巴胺对牛肾上腺髓质嗜铬细胞BK_Ca通道 有激活作用^［4］。我们设想多巴胺引起冠脉血管平滑肌的舒张是通过刺激BK_{C a}通道开放引起的。本研究采用膜片钳技术观察多巴胺对猪冠状血管平滑肌BK_Ca活 性的影响及其信息传递机制。

1材料和方法

1．1细胞分离

与以往的细胞分离方法基本相同^［3］。新鲜猪心由屠宰厂取得。在无菌条件下，分 离左前降支冠状动脉,放入Kreb-Henseleit缓冲液中。在显微镜下去掉内外膜，保留平滑肌层，将其剪碎成1～2 mm³的组织块，0．001％木瓜蛋白酶消化30 min，吸管吹打，使细胞 游离。1 000 r/min离心，去除上清液，加入细胞孵育液，成分是(mmol/L):KCl l40，MgCl 10，CaCl₂0．1,HEPES 20和葡萄糖 30(pH7．4)。制成细胞悬液，保存在4℃，实验 在6～8 h内进行。1．2单通道记录

实验采用细胞贴附式膜片，电极液成分为(mmol/L)：NaCl 140,KCl 5，CaCl₂ 1，MgC l₂ 2,HEPES 10(pH7．4)。实验时将拉制成的尖端阻抗为2～5 MΩ的玻璃微电极尖端与细 胞膜表面形成高阻抗封接，阻抗大于10 GΩ。单通道电流信号经膜片钳放大器(Axopatch 2 00- A Patch-Clamp amplifler)放大后，通过A／D、D／A转换器(axon instrument)输入计算机 ，电流信号的采集和分析采用pClamp 6.0．1软件进行处理。以开放概率(Np_o)表示通道的 活性。

1．3药品

木瓜蛋白酶，普萘洛尔（Sigma公司产品）；多巴胺，SCH23390，SQ22536（Research B iochemicals International 公司产品），CPT-cyclic AMP，Rp-8CPTcAMPs（Biolo g Life Science公司产品）。

1．4结果统计

实验结果用均数±标准差(±s)表示，进行两样本均数的t检验。

2结果

2．1多巴胺对BK_Ca通道活性的影响

膜电位为+40 mV．多巴胺浓度分别为1μmol/L，3μmol/L，10μmol/L时15 min 内，BK_Cca通道开放概率P₀由0．002±0．002分别增加到0．058±0．008(n =4 )，0．27±0．12(n=5)及0．550±0．087(n=10)(P＜0．01)。开放概率明显增 加，而且具有剂量依赖性(图1)。

Fig.1 Dopamine stimulates BK _Ca channel activity in myocytes from coronary arteries

(A) Continuous 2-second traces from the same cell-attached patch (+40 mV) bef ore and 15 minutes after application of 10 μmol/L dopamine. Dotted line indic ates channel closed state, and upward deflections are channel opening. (B) Effec t of various concentrations of dopamine on BK_Ca channel activity(Np 0) recorded from cell-attached patches (+40 mV,n=4-10). Channel activity (Np₀) was calculated for a 100 msec test pulse to +40 mV, and plotted as a vertical bar on the activity histogram

2．2多巴胺能受体拮抗剂对多巴胺激活BK_Ca通道作用 的影响

普萘洛尔预处理细胞，没有阻抑多巴胺对BK_Ca通道的激活作用。用5μmol/L 普萘洛尔孵育血管平滑肌细胞30 min后，再加入10 μmol/L多巴胺，仍然使BK_Ca通 道开放概率从0．005±0．004增加到0．617±0．151(n=5， P＜0．01)，而用10 μmol/L SCH23390孵育血管平滑肌细胞30 min后。再加入10μmol/L 多巴胺，却没有观察到 有BK_Ca通道被激活(n=5， 图2)，表明SCH23390可完全阻断多巴胺的激活BK Ca通道的作用。

2.3cAMP对多巴胺激活BK_Ca通道作用的影响

SQ22536(100 mol/L)预处理细胞可完全阻断多巴胺激活BK_Ca通道的作用(n=5 )。另取细胞悬液，灌流100 μmol/L CPT-cAMP则可增加BK_Ca通道的P₀从0．008 ±0．007到0．192±0．03(n=5， P＜0．01，图3)。

2．4蛋白激酶抑制剂对多巴胺激活BK_Ca活性的影响

无论是在灌流多巴胺之前或之后，50μmol/L RP-8CPT-cAMP处理细胞不能阻抑10 μmol/L多巴胺激活BKca通道的作用，BK_Ca通道开放概率由灌流多巴胺前的 0．001 ±0．001增加到0．456±0．158(n=10,P＜0．01)。相反如用KT5823则可完全 反转多巴胺的效应，灌流10μmol/L多巴胺BK_Ca通道开放概率由0．001±0．001增 加到0．318±0．132，加入300μmol/L KT5823后，BK_Ca通道开放概率降低到0.02 1±0．012(n=9，P＜0．01)。 5μmol/L普萘洛尔存在于孵育液中的条件下观察到 的结果如图4所示。

Fig.2 Stimulatory effect of dop amine on channel involves DA-1 dopamine receptors, but not adrenoceptors