摘要 目的和方法：研究肺动脉内皮细胞(PAEC)在低氧性肺水肿(HPE)发生中的作用机 制，采用PAEC体外培养的方法，观察了PAEC生长状态和特征性蛋白因子Ⅷ相关抗原(ⅧR：Ag )的变化，并利用PAEC融合单层通透性模型研究了低氧对PAEC融合单层的通透性的影响。结果：PAEC生长数量无明显变化，但细胞的生长质量下降，ⅧR:Ag阳性细胞数明显 下降，PAEC通透性明显增加，CaM阻断剂TFP只能部分抑制这种通透性增加。说明PAEC单层通 透性的增加，除细胞自身骨架收缩外，主要是PAEC生长状态变化引起的。结论： PAEC通透性增加是HPE的一个重要因素。

中图分类号：R852.11文献标识码:A文章编 号：1000-6834(2000)01-0041-04

THE CHANGE OF PULMONARY ARTERY ENDOTHELIAL CELL DURING HYPOXIA

HONG Xin, YIN Zhao-yun, SUN Xing-bin, LU Yon-gda

(Institute of health and environmental medicine Acadmy of mi litary medical sciences, Tianjin 300050)

ABSTRACT

Aim and methods: To investigate the role of pulmonary artery endothelial cell(PAEC)on the mechanism of hypoxic pulmonary edema (HPE), the growth situati on, the characteristic of endothelial cells (factor Ⅷ related antigen), the per meability of the monolayer PAEC were investigated during hypoxia using the PAEC cultured in vitro as a model. Results: The growth number of PAEC either in hypoxia or normoxia conditions revealed no difference during the peri od of 48 hour cultured(P＞0. 05). The numbers of positive immunofluoescence P AEC of factor Ⅷ related antigen in PAECs of hypoxic groups were lower than thos e of normoxic groups. PAEC monolayer permeability of albumin was significantly e nhanced in hypoxic groups compared with those in normoxic groups. The inhibitor of calmodmin, TFP only partly attenuated the enhancement of the permeability. Th ese results indicated that, apart from the contraction of cytoskeleton protein o f cells that lead to the formation of the intercellular gaps, the main reasons f or the change of permeability is the growth situation of the PAEC during hypoxia . Conclusions: The change of the PAEC permeability would play an imp ortant role in the occurrence of the HPE.

KEY WORDS: hypoxia;pulmonary artery endotheli al cells;permeability

环境低氧可导致急性HPE，高原肺水肿即是其中一种，其发生机制目前尚不十分清楚，较为 肯定的有血液动力学改变以及体液潴留等学说^［1］，如低氧性肺动脉高压、利尿因 子ANF分泌减少、组织Na²⁺K⁺储留等。这些都从整体上对HPE的发生做了解释，但这 只为HPE的发生提供了条件。HPE的最终发生还是通过血管通透性改变而实现的，但目前还缺 乏这方面的直接证据，所以有必要开展低氧对血管通透性影响研究。内皮细胞是衬覆于血管 内面的一层扁平细胞，作为组织与血液间的第一道屏障，对血管的通透性调节起着至关重要 的作用^［2，3］。为此,本文建立了肺动脉内皮细胞(PAEC)融合单层的通透性模型， 观察了低氧条件下PAEC单层的通透性变化，并对其可能机制进行了探讨。

1材料与方法

1．1PAEC的体外培养^［4］

选用肉联厂检疫合格的健康成年猪，1～5y，体重100～150kg,雌雄不拘。活杀，在相对 无菌条件下分离肺动脉，并将游离下来的血管放入无菌D-Hank’s液，4℃保存，2～3 h内 培养。以0．25％胰蛋白酶消化内皮细胞，1500 r/min，离心消化液10 min。弃上清，向离 心管内加入M199培养液(含有20%胎牛血清，10 mmol/L HEPES，双抗0.1 ml/L, pH7．4)将 细胞制成悬液，吸取200 μl细胞悬液用0．4％台盼蓝染色后，计活细胞数，调整细胞浓度 至10⁵cells/ml接种于培养瓶中，放入37℃、5％CO₂、饱和湿度的CO₂培养箱内培养。 在相差显微镜下从形态学上对细胞进行鉴定，同时根据Jaff法从免疫学上对细胞进一步鉴定 ^［5］。长成单层后及时传代。

1．2实验分组

选取5～10代生长良好融合单层的PAEC，以10⁵cells／ml密度接种于培养瓶中，持细胞长 成融合单层时，更换含10%胎牛血清的培养液，随机分为低氧组和对照组，每组分别设不同 的时间点，观察PAEC功能和PAEC单层通透性的变化。低氧组的实验条件为3%O₂、92%N₂ 、5%CO₂、饱和湿度：对照组的实验条件为21％O₂、74%N₂，其余条件与低氧组相同。

1．3生长曲线的测定

取各时间点的PAEC，消化制成细胞悬液，吸取200 μl PAEC悬液染色计数，求出均值。 以培养天数为横坐标，细胞数的纵坐标，绘出生长曲线。

1.4ⅧR：Ag的测定

细胞免疫荧光染色：将细胞制成悬液，1500 r/min，离心10 min，D-Hank’s液冲洗 三次，4%甲醛固定，然后根据Jaff法对VⅧR：Ag进行染色，细胞终浓度不小于10⁶cells ／ml。用流式细胞仪测定PAEC的ⅧR：Ag荧光阳性细胞数。

仪器条件：FACS-440型流式细胞仪(美国Becton-Dickinson公司)，SW氩离子激光器，输功 率0．26 w，激发光波长488 nm。前置滤光片，使光电倍增管接收绿色免疫荧光，用戊 二醛 固定的鸡血细胞校正仪器，使仪器CV值稳定在3％以内。改变前向角以去除细胞碎片的干 扰，每个样品记数10⁴个细胞，从中分析大小形态在正常范围内约8700个内皮细胞， 采用PDP 11／73计算机log单参数1024道直方图实时收集处理数据。

1.5PAEC融合单层的通透性模型的建立及对白蛋白通透牲的影 响

细胞融合单层的通透性模型主要是利用微孔滤膜既可做为细胞支持物又具有很好的通透 性的特点而建立的^［6］。取制备好的细胞悬液接种于已铺好5 μm微孔滤膜的细胞之 中，接种密度为5×10⁵ cells／m1。3～6 d后，细胞在滤膜上长成融合单层后取出用于 实验。将长满内皮细胞的微孔滤膜平铺在经过改造的趋化小槽内，上面再覆盖一层0.8 μm 的微孔滤膜(此层可略去)，装槽完毕后将趋化小槽放入已加入培养液的24孔培养板的小井中 。最后在趋化小槽中加入2 ml 含2％BSA的培养液，经过不同时间不同条件培养后，分别 取小槽内和小井内的培养液，采用溴甲酚绿法对BSA进行检测，根据PAEC单层上下培养液中 BSA的比值来分析通透性的变化。

实验前滤膜需经处理方能用于细胞生长。直径25 mm的5 μm微孔滤膜，首先放入50℃0 .5％HAc溶液20 min，25℃无离子水冲洗2～3次，放入100℃、5 mg／L明胶液中浸泡，1 h后 吹干，最后将滤膜放入100℃电烤箱烤1 h，无菌存放，1 w内使用。用前在滤膜表面滴加20 μl 1％的Fibronectin。

1．6数据处理

实验数据采用均数±标准差（±s)表示，以t或F检验进行数据 统计分析。

2结果

2．1细胞鉴定

长成单层的PAEC呈鹅卵石形状，对其ⅧR：Ag进行免疫荧光染色，细胞呈现阳性反应， 证实为内皮细胞(照片略)。

2．2生长曲线

在各培养时间取出细胞，对细胞进行计数后，给出细胞生长曲线(图1)。无论是在低氧 或是常氧条件下，细胞均呈指数生长，但两组细胞在48 h观察范围内生长数量无明显差异( P＞0．05)。

2．3ⅧR：Ag的变化

PAEC在常氧和低氧条件下培养不同时间后，用流式细胞仪分析PAEC内ⅧR：Ag的荧光变 化(表1)。常氧条件下ⅧR：Ag阳性率均在80％以上，培养的时间长短对ⅧR：Ag的阳性率无 明显影响。在3％O₂的低氧条件下，2 h后ⅧR：Ag的阳性率即明显下降，并随着培养时间 的延长，其阳性率进一步下降。低氧24 h后则基本稳定不再继续下降(低氧24 h、48 h与低 氧12 h比，P＞0．05)。

Fig.1 Curve of the growth of PAGE

2．4PAEC融合单层通透性模型

PAEC在经过胶原处理的微孔滤膜上贴附效果良好，尤其是滤膜再铺加Fibronectin后， 使PAEC更易贴附长成均匀的融合单层细胞，细胞生长良好。

经过胶原和Fibronectin处理的微孔滤膜对BSA通透并不是无限的，无融合单层内皮细胞 的单纯胶原微孔滤膜,加入白蛋白，放入CO₂培养箱，2 h后下上两槽白蛋白含量的比值(R) 为：0．53±0．03，24 h后为0．97±0．05，接近于1。为精确计算内皮细胞融合单层对白 蛋白的通透性，需剔除胶原微孔滤膜的<