摘要 目的：研究9-蒽羧酸(9-AC)对豚鼠心室肌动作电位(AP)和L型Ca电流(I_{C a})的影响。方法：电流钳配合制霉菌素膜穿孔方法记录心室肌动作电位， 用全细胞式膜片钳(Whole-cell recording)技术记录I_Ca。结果：在 低Cl^-状态下，β肾上腺素能受体激动剂异丙肾上腺素(ISO)可使动作电位时程(APD)明 显延长。9-AC单独使用时对AP无作用，但在ISO的作用下，蛋白磷酸酶抑制剂9-AC可使APD 进一步延长，ISO和9-AC的作用可被Ca²⁺通道阻断剂硝苯地平(3 μmol/L)所反转。 电压箝实验发现，在β-肾上腺素能受体激动剂ISO激发下，9-AC使I_Ca的幅度进一 步增加。结论：9-AC与ISO有协同作用。本文结果提示9-AC敏感性蛋白磷酸酶 参与Ca²⁺通道的调控过程。

中图分类号：R337.5文献标识码：A文章编 号：1000-6834(2000)01-0022-04

EFFECTS OF ANTHRACENE-9-CARBOXYLIC ACID ON CARDIAC VENTRICULAR ACTION POTENTIAL DURATION AND L-TYPE Ca²⁺ CHANNEL IN GUINEA PIG

ZHOU Shi-sheng, WANG Yue-min, DONG Ling, ZANG Yi-min

(Department of Physiology, The Fourth Military Medical Univer sity, Xian 710032)

ABSTRACT

Aim and methods: The effects of anthracene-9-carboxylic acid (9-AC) o n guinea pig cardiac ventricular action potential (AP) and L-type Ca²⁺ cu rrent (I_Ca) were investigated using the perforated patch recordings and t he whole-cell patch clamp technique, respectively. Results: Under l ow Cl^- condition (1.8 mmol/L ［Cl^-］₀/2.5 mmol/L ［Cl^-］_i), isoprote renol (ISO), a B-adrenoceptor agonist, induced a significant increase in the ac tion potential duration (APD), especialty in APD₅₀. 9-AC alone did not sh ow any influence on AP, however, in the presence of ISO, extracellular applicati on of 9-AC made the APD further prolonged. The effects of both ISO and 9-AC w ere reversed completely by a Ca^2＋ channel blocker, nifedipine (3 μmol/L ). 9-AC was found to increase cardiac L-type Ca²⁺current (I_Ca) aft er the channels were first activated by ISO. Conclusion: The present results indicated that there is a synergistic effect of 9-AC and ISO on I_{C a}, suggesting that 9-AC-sensitive phosphatase is responsible not only for th e dephosphorylation of CFTR Cl^- channels, but also for that of L-type Ca^{2 +} channels.

KEY WORDS:anthracene-9-carboxylic acid;isoprot erenol;action potential;Ca current

最近，我们发现9-蒽羧酸(9-AC)能特异地抑制豚鼠心室肌内某种蛋白磷酸酶(9-AC敏 感性蛋白磷酸酶)，使CFTR(Cystic fibrosis transmemrane conductance regulator)Cl -通道的脱磷化过程明显减慢，因而具有增强异丙肾上腺素(ISO)激发的CFTR Cl^-电流 的作用^［1］。鉴于上述发现，进一步观察9-AC对其它心肌离子通道的影响，不仅有 助于阐明9-AC的作用机制，而且有助于了解蛋白磷酸酶的作用及其活性调节。由于心室肌L 型Ca²⁺通道的调控途径与CFTR Cl^-通道相似^［2］，二者都能被β肾上腺素 能受体激活、细胞内的信号转导都是通过cAMP蛋白激酶A(PKA）-磷酸化途径、通道的关闭 有赖于蛋白磷酸酶的活性等。因此，本文观察了9-AC对L型Ca²⁺通道的作用，以探讨 9-AC敏感性蛋白磷酸酶与L型Ca²⁺通道的关系。

1材料和方法

1.1分离单个心室肌细胞

分离单个心室肌细胞所用方法及液体同文献报道^［1］，简要步骤如下：雌性豚 鼠 (100～150 g)，苯巴比妥钠(35 mg／kg)腹腔注射麻醉，人工呼吸下行主动脉插管，摘除心 脏，依次用36～37℃台氏液(2～3 min)、无钙台氏液(2～3 min)、含0．1 mg／ml胶原酶(Ya kult)和0．7 mg／ml BSA无钙台氏液(6 min)、KB液(5 min)逆性灌流心脏，之后，剪除心 脏其它组织，将心室部分放入适量KB液中，用剪刀轻轻剪成碎块并过滤，含心肌的KB液室温 下保存备用。

1．2实验所用液体(mmol/L)

1．2．1用于电流钳实验的液体(1)灌流液Na-gluconate 143,K-glu conate 5.4,NaH₂PO₄ 0.3,CaCl₂ 1.8,MgSO₄ 0.5,glucose 5.5,HEPES 5(pH用NaOH 调至7.4)。（2）电极液K-aspartate 128.5,KCl 1.5,EGTA 5,MgCl₂ 0.5,Na₂-creat inephosphate 5,Mg-ATP 5,HEPES 5(pH用KOH调至7.35)。

1.2.2记录L型Ca²⁺电流的液体（1）灌流液NaCl 104,mannito l 90,MgCl₂ 0.5,CaCl₂ 1.8,glncose 5.5,HEPES 5(pH用NaOH调至7.4)。(2)电极液CsC l 85,MgCl₂ 0.5,EGTA 10,TEA-Cl 20,Na₂-Creatinephosphate5,MgATP10,glucos e5.5,HEPES 10(pH用CsOH调至7.35)。

1．3药品

9-AC、ISO和硝苯地平(Nifedipine)均为Sigma公司产品。9-AC和硝苯地平分别溶于二甲基 亚砜，制成0．5 mol/L和10 mmol/L的母液，经分装后，保存于-20℃冰箱备用。二甲基亚砜 的终浓度＜0．2％。

1．4电生理实验

实验选用Φ1．5 mm硅硼玻璃电极毛坯，经拉制后，使充灌后的电极尖端电阻为2．0～ 2．5 MΩ。取100 μl细胞悬液加入灌流槽内，静息5 min使心室肌细胞充分贴壁。在吸破细 胞后，让电极内液与细胞内液平衡5 min，然后再开始正式记录。全细胞记录的膜电流经膜 片钳放大器(Axopatch 200 A)放大，通过Bessel型滤波器(2 kHz)及A／D转换器(PCM 501 ES ，Sony)后，由计算机(PC9801 DX，NEC)采样、分析及处理。方波脉冲由电子刺激器(SEN 3301，Nihon Kohden)产生。记录Ca²⁺电流时，保持电位为-40 mV，使Na⁺通道处于 失活状态，同时，细胞内外均采用无K⁺液，并在电极内液加用TEA,以消除Na⁺和K⁺电 流的干扰。

电流钳配合膜穿孔方法记录动作电位：本文采用了Yawo和Chuhma(1993)介绍的改良制霉 菌素穿孔方法^［3］。通常在高阻封接形成后，膜电位即进行性降低，膜电位在10 min左右达到静息电位水平。

实验在室温(23～25°C)下进行。

1.5统计学处理

文中数据以均数±标准差(±s)表示，用配对t检验作统计学显著性分 析。

Fig．1Effects of anthracene-9- carboxylic acid on cardiac ventricular action potential duration(n=4)

Action potentials were elicited by applying current pulse (1 ms，3 nA) every 10 second．A)1. Control; 2.After 2 min application of ISO (1 μmol/L)；3.ISO+9 -AC(0．5 mmol/L)；4.After washout of 9-AC．B) 1.Control；2.After 2 min applica tion of ISO (1 μmol/L)；3.ISO+9-AC (0．5 mmol/L)；4.After 2 min application o f nifedipine (3 μmol/L)

2结果

2．19-AC对豚鼠心室肌动作电位时程(APD)的影响

由于β肾上腺素能受体兴奋时，既能激活L型Ca²⁺通道，又能激活CFTR Cl^-通 道，为了尽量减小CFTR Cl^-电流对实验结果的干扰，实验中用低Cl^-液(［Cl^-］。／［Cl^-］_i＝1．8 mmol／L/2．5 mmol/L)。低Cl^-状态下记录的APD基本与文献 报道一致，表明低Cl^-对基础动作电位影响不大(表1)。当灌流液中加入ISO(1 μmol/ L)后，APD显著延长，从动作电位起点到复极化完成50％所需的时间(APD₅₀)延长最 明显(表1)，同时平台抬高明显。在ISO作用的基础上，9-AC可使ISO的效应进一步加强(图1 )，而单独使用9-AC(0．5 mmol/L)时，对AP无作用(n＝4，结果未显示)。ISO和9-AC 的作用可被Ca²⁺通道阻断剂硝苯地平(3 μm)完全反转(图1B,n=4)。ISO和9-AC对 动作电位的幅度无明显影响，提示9-AC延长APD可能与I_Ca增加有关。

2．29-AC对豚鼠心室肌L-型Ca电流的影响

在记录I_Ca时，ISO和9-AC同样会影响到CFTR Cl^-通道。根据在等Cl^-梯度下 CFTR Cl^-电流的反转电位为0 mV这一特性^［1］，本文选用等Cl^-梯度液体，以降 低CFTR Cl^-电<