摘要用膜片钳全细胞记录法观察关附甲素(GA)对分离的单个豚鼠心室肌细胞L型钙通道电流(I_Ca-L)和内向整流钾电流(I_k1)的影响。结果表明：GA抑制I_Ca-L：8，40 μM GA使I_Ca-L最大峰值从1 020.8±197.3 pA分别降至523.0±101.8和429.6±120.0 pA(n=5,P均＜0.01)，抑制率分别为48.8％和57.9％，GA使I_Ca-L的电流-电压曲线上移，但不改变其激活、峰值和反转电位。GA对I_k1没有影响，不改变I_k1的电流-电压曲线形态，亦不改变细胞的静息膜电位。结果提示GA对I_ca-L的阻滞作用为其抗心律失常效应的离子基础之一。

The Effects of Guanfu base A on L-type Calcium Channel Current and Inward Rectifier

Potassium Current in Isolated Guinea Pig Ventricular Cells

Pei Dean,Li Gengshan,Jiang Xijia,et al

(Department of Cardiology,The First Affiliated Hospital,Hubei Medical University,Wuhan,430060)

AbstractThe effects of Guanfu base A (GA) on L-type calcium channel current (I_ca-L) and inward rectifier potassium current (I_k1) were investigated in isolated single ventricular cells from guinea pig hearts using patch clamp whole-cell recording.I_Ca-L was decreased by GA at 8,40 μM from 1 020.8±197.3 pA to 523.0±101.8 and 429.6±120.0 pA (n=5,P＜0.01 respectively),and their inhibitory rates were 48.8％ and 57.9％ respectively.GA shift up the I-V curve of I_Ca-L,while its active,peak and reverse potentials didnt change.GA had no effects on I_k1,and couldnt change resting potential of ventricular cells.The results suggest that GA blocks I_Ca-L,which may contribute to its antiarrhythmic action.

Key wordsGuanfu base APatch clampVentricular cellL-type calcium channelInward rectifier potassium channelGuinea pig

关附甲素(Guanfu base A,GA)对心肌细胞钠通道有阻断作用^［1］。本文用膜片钳全细胞记录法研究GA对分离的单个豚鼠心室肌细胞L型钙通道电流(I_Ca-L)和内向整流钾电流(Inward rectifier potassium current,I_k1)的作用，旨在进一步探讨其抗心律失常效应的离子基础。

1材料与方法

1.1单个心室肌细胞分离取体重250～350 g健康豚鼠，按文献［2］报道的双酶酶解法(胶原酶I+蛋白酶E，Sigma公司生产)分离豚鼠单个心室肌细胞，分离的细胞于4℃保存在KB液中备用。所用KB液成分见文献［1］。

1.2膜片钳全细胞记录玻璃微电极经PB－7型双步拉制器(Narishige，日本)拉制而成，充填电极内液后阻抗在2～3 MΩ。电极内液成分参见文献［1］ 。吸几滴细胞悬液于自制的心肌细胞灌流槽中，在生物倒置显微镜下观察，待细胞粘附于槽底后，以充氧细胞外液灌流，流速为2 ml/min，冲去死亡细胞碎片。选取表面光洁横纹清晰的心肌细胞按Hamill等^［3］方法进行膜片钳全细胞记录。细胞外液成分(mmol/L):NaCl 50、Choline Chloride 100、KCl 5.4、CaCl₂ 1.8、NaH₂PO₄ 0.25、HEPES 10、Glucose 10，用NaOH调pH至7.3。通过计算机由pClamp软件(5.51版本，美国Anon公司)经数/模(D/A)转换发放脉冲，通道电流信号经Ag/AgC1丝引导由膜片钳负反馈放大器(CEZ－2300，日本光电)放大，经模/数(A/D)转换后存于硬盘中，实验结果由pClamp软件分析。

1.3实验步骤①维持电位(HP)=-40 mV使钠通道完全失活^［4］，同时使T型钙通道失活^［5］，由于本研究对象为豚鼠心室肌细胞，因而记录不到瞬间外向钾电流(Transient outward potassium current,I_to)^［6］，因而排除了I_to对I_Ca-L的影响。在刺激频率0.5 Hz、HP=-40 mV，逐级去极化到+60 mV，每级10 mV、钳制时间(Clamp time,CT)250 ms，诱发出I_Ca-L。同一细胞完成上述实验后，分别以含8，40 μM GA的细胞外液灌流5 min后各重复实验一次。以不同电压水平的I_Ca-L峰值与相应的膜电位作图绘制I_Ca-L的电流-电压(I-V)曲线，以I_{Ca-L max}作为I_Ca-L的观察指标。为避免长时间记录时Run down现象对实验结果的影响^［7］设立空白对照组，即在相同条件下引出I_Ca-L后，以不含GA的细胞外液灌流，每5 min重复实验一次，共2次，仍以I_{Ca-L max}作为I_Ca-L的观察指标。②HP=-40 mV超极化到-100 mV，然后逐级去极化到+30 mV，每级10 mV、CT=500 ms，刺激频率0.5 Hz，诱发出I_k1电流，观察40 μM GA灌流5 min后，Iki超极化到-100 mV时I_k1的变化，以钳制脉冲结束时的电流大小代表I_k1电流，同时以不同的膜电位和其相应的I_k1电流绘制I_k1的I-V曲线。

1.4统计学处理数据以±s表示，采用t检验进行统计学处理，以P＜0.05为差异有显著性。

2结果

2.1GA对I_Ca-L的影响8，40 μM GA使I_{Ca-L max}从用药前的1 020.8±197.3 pA分别降至523.0±101.8 pA和429.6±120.0 pA(n=5)，与用药前比较差异有显著性，P均＜0.01，分别下降了48.8％和57.9％。空白对照组灌流5，10 min时I_{Ca-L max}由灌流前的1 078.4±203.8 pA分别降至1 033.1±208.3 pA和1 002.2±198.6 pA(n=5)，分别下降了4.2％和7.1％，其中灌流10 min时I_Ca-Lman与灌流前比较，差异有显著性，P＜0.05。而且8，40 μM GA灌流5 min分别与空白对照组灌流5和10 min相比较，差异有显著性，P均＜0.01。

2.2GA对I_Ca-LI-V曲线的影响GA使I_Ca-L的I-V曲线上移；浓度增加，I-V曲线亦上移。两种浓度的GA均不改变I_Ca-L的激活电位(-20 mV)、峰值电位(+10 mV)和反转电位(+60 mV)，见图1。

图1GA对I_Ca-L I-V曲线的影响HP=-40 mV，

逐级去极化到+60 mV，每级10 mV、CT 250 ms，刺激频率0.5 Hz

2.3GA对I_k1的影响40 μM GA灌流5 min后，Iki超极化到-100 mV时，I_k1由灌流前的-1 765±543.5 pA变为-1 400±482.3 pA(n=4)，但灌流前后Iki变化无明显差异，P＞0.05。

2.4GA对I_k1 I-V曲线的影响I_k1 I-V曲线呈“N”形，表现为明显的内向整流特性，GA不改变I_k1的I-V曲线形态、不改变细胞的静息膜电位(灌流前后细胞的静息膜电位均为-75 mV)，亦不使其向左右移动，见图2。

图2GA对I_k1 I-V曲线的影响HP=-40 mV，超极化到-100 mV，

然后逐级去极化到+30 mV，每级10 mV、CT 500 ms，刺激频率0.5 Hz

3讨论

膜片钳技术可以直接测定膜离子通道电流的大小，是研究药物对离子通道活性影响的最为直接手段。而研究药物对I_Ca-L的影响时，对实验结果有显著影响的一个因素就是I_Ca-L的Run down现象^［7］，本实验设计采用了严格的空白对照组，即在相同条件下引出I_Ca-L后，比较不含GA的细胞外液灌流5 min和含GA的细胞外液灌流5 min时I_Ca-L的大小。本实验空白对照组灌流10 min I_Ca-Lmax与灌流前比较，差异有显著性(P＜0.05)，说明长时间记录时I_Ca-L存在有Run down现象，然而8 μM GA和40 μM GA均灌流5 min分别与空白对照组灌流5和10 min比较均有显著性差异，P均＜0.01，说明GA灌流后I_Ca-Lmax的降低主要是由于GA对L-型钙通道阻滞所致而非Run down现象引起，亦即GA对I_Ca-L有阻滞作用，并呈一定的浓度依赖性。不同浓度GA使I_Ca-L I-V曲线上移，但不改变其激活电位、峰值电位和反转电位，提示GA在不同膜电位水平对I_Ca-L呈均匀一致的同等程度阻滞。GA对I_Ca-L的阻滞作用为GA的抗心律失常作用机制之一，也可解释GA在多细胞标本上使动作电位缩短的原因^［8］。另外，由于I_k1主要参与心房肌和心室肌静息电位的形成，本实验结果说明GA对I_k1没有影响，表明GA不影响细胞的静息膜电位。

参考文献

1裴德安，李庚山，蒋锡嘉，等．<