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［中图分类号］R544.1［文献标识码］A
［文章编号］1000-4718(2000)10-0891-03
Relationships between ouabain of plasma and tissues
and blood pressure in lklc hypertensive rats
YUAN Wei-qing
（Department of Cardiology, First Teaching Hospital）
WANG Hao
（Department of Cardiology, First Teaching Hospital）
LU Zhuo-ren
（Department of Cardiology, First Teaching Hospital）
YUAN Yu-kang
（Department of Immunology, Xi'an Medical University, Xi'an 710061， China）
REN Hui-xun
（Department of Immunology, Xi'an Medical University, Xi'an 710061， China）
［Abstract］ AIM: To explore the role of endogenous ouabain (EO) in the development of hypertension and its secretion character in 1k1c hypertensive rats(HR). METHODS: EO contents of plasma and tissues in 1k1c HR were detected by ELISA. The relationships between plasma and tissues ouabain and blood pressure were analyzed. RESULTS: EO contents of plasma, heart, kidney, adrenal gland, pituitary and hypothalamus in lklc HR were significantly higher than those of normal rats, especially in the adrenal gland and hypothalamus. EO contents of serum, kidney and hypothalamus were correlated with blood pressure. CONCLUSIONS: EO might play an important role in the development of hypertension in 1k1c hypertensive rats. Adrenal gland might be the major source of EO.
［MeSH］ Ouabain; Hypertension, renovascular; Rats; Blood pressure
内源性哇巴因(endogenous ouabain, EO)，即既往所称的“内源性类洋地黄物质(endogenous digitalis-like substance, EDLS)”或“内源性钠泵抑制物(endogenous sodium pump inhibitor, ESPI)”是新近发现的主要由肾上腺皮质所分泌的一种类固醇激素，盐、血容量扩张及血管紧张素II(angiotensin II, AngII)等因素可刺激其分泌增加，具有重要的生理和病理生理意义。大量证据表明，EO升高可能是高血压的发病因素之一［1-6］，而高血压研究的一种重要的动物模型“一肾一夹(1k1c)”高血压大鼠血清及组织内EO含量的改变及这种改变在血压升高中的意义国内外未见报道。本研究采用高度灵敏与特异的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法，测定“一肾一夹”高血压大鼠体内EO含量的改变，并对血清及组织内EO含量与大鼠血压进行相关性分析，旨在进一步揭示EO的分泌特点及其在该模型血压升高中的作用。
材料和方 法
一、“一肾一夹”高血压大鼠模型的制备
选择180-210 g雄性SD大鼠(n=14)，参照文献［7］介绍的方法制备“一肾一夹”高血压模型：用内径为0.30 mm的U形银夹夹住左肾动脉，1周后切除对侧肾脏。8只正常SD大鼠为对照组。每周2次间接法尾动脉监测血压（MRB-IIIA型大鼠血压心率测定仪，上海高血压研究所监制）。术后4周处死动物采集血清及心脏、肝脏、肾脏、肾上腺、垂体、下丘脑等脏器备测。
二、ELISA检测法测定大鼠血清及组织内EO含量
(一)样本的采集及处理［8］
1. 血清样品处死动物前一夜禁食、禁水。收集血清，等体积的0.1%三氟乙酸酸化标本，室温混合3 h，3 000 g离心30 min，取上清液注入已做预处理的C18固相柱内，接负压装置使标本通过小柱，去离子水冲洗3次，25%乙腈洗脱结合的哇巴因，收集洗脱液，冷冻干燥后0.01 mol/L pH 7.4 PBS溶解备测。
2. 大鼠组织样品摘取大鼠相应组织，生理盐水冲洗血液并用滤纸吸干后加入约10倍体积的甲醇，2 mol/L抗坏血酸，匀浆，离心后收集上清液并冻干，然后溶于0.1%三氟乙酸，过C18固相柱，以下操作同血清的处理。
(二)ELISA检测法测定大鼠血清及组织内哇巴因含量参照本实验室建立的方法测定EO含量［9］，具体步骤如下：①包被：以1 mg/L的“卵清蛋白-哇巴因”包被96微孔板，100 μL/孔，4℃过夜(18-24 h)，洗板。②封闭：加入含2%牛血清白蛋白(BSA)的0.01 mol/L PBS(pH 7.4)，200 μL/孔，37℃ 1 h，洗板。③加样：以双蒸水配制哇巴因标准，浓度为0.39, 0.78, 1.56, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50 μg/L。分别加入50 μL的标准液或待测血清至标准孔和标本孔中（每份标准品及待测样本均做双孔，取两孔平均吸光度为测定值），并于每孔中加入50 μL的兔抗哇巴因抗体(自制，1∶12万稀释)，振荡混匀后37 ℃温育2 h，洗板。④加入辣根过氧化酶标记羊抗兔二抗（华美生物工程公司，效价1∶1000），100 μL/孔，振荡混匀后37℃温育30 min，洗板。⑤显色：立即于各孔中加入OPD底物溶液，100 μL/孔，室温反应30 min，2 mol/L硫酸50 μL终止反应。⑥比色：490 nm测定吸光度。绘制标准曲线，计算待测样本中EO含量。
三、统计处理
实验数据均以均数±标准差（±s）表示，应用MS Excel5.0统计软件采用配对资料的t检验及直线相关分析对数据进行处理。
结 果
一、实验过程中大鼠血压的动态变化
与术前比较，摘除肾脏后1周1k1c大鼠血压即升高［(17.4±1.8） kPa vs （13.9±1.6） kPa，P＜0.01］，术后4周血压明显升高［(22.0±2.3） kPa vs （13.9±1.6） kPa，P＜0.01］。而正常大鼠组血压变化不明显。
二、血清及组织内EO含量的测定（图1）
Fig 1EO contents of serum and tissues in 1k1c compared with those of normal rats.*P＜0.05，**P＜0.01 vs normal rats.
1“1k1c”高血压大鼠及正常大鼠血清和组织内EO含量的比较
由图1可见，“1k1c”高血压鼠血清及心脏、肾脏、肾上腺、垂体及下丘脑内EO含量均高于正常大鼠；而无论正常大鼠，还是“1k1c”高血压鼠，均为肾上腺及下丘脑内EO含量高于其它组织及血清EO含量。
三、“一肾一夹”大鼠血清及各组织内EO含量与血压的相关性分析
本研究发现，“1k1c”高血压鼠血清、肾脏及下丘脑内EO含量与大鼠血压呈显著正相关，相关系数r分别为0.592，0.632，0.521（均P＜0.05），而心脏、肝脏、肾上腺、垂体内的EO含量与血压相关性不明显。
讨论
“1k1c”高血压大鼠体内存在着明显的钠水潴留、肾素血管紧张素系统激活以及交感神经活性增高［7］。而这些因素可能是引起“1k1c”高血压大鼠体内EO升高的主要原因：①血容量扩张。诸多研究表明血容量扩张可引起EO分泌明显增加。在“DOCA+盐”及“部分肾切除+盐”型等多种主要由于钠水潴留及容量负荷增加所引起的高血压动物模型体内EO含量均见增高，并在血压升高的机制中起着重要作用［2,6］。②肾素血管紧张素系统激活。新近Laredo等［8］用细胞培养的方法观察到 AngII可使肾上腺皮质球状带细胞的培养液中EO浓度明显增加，为AngII刺激EO分泌提供了直接证据。③交感神经活性增高。Yamada等［10］的研究发现，中枢交感神经损伤可引起下丘脑及血浆EO水平分别下降90%及70%，提示“1k1c”高血压大鼠交感活性增高可能是体内EO含量增高的原因之一。
本研究表明肾上腺中EO含量较其它组织明显增加，与国外报道的结果相似［1］，提示肾上腺可能是EO的来源之一。国外有研究发现，人和牛肾上腺皮质培养细胞可分泌EO，提示肾上腺皮质可能是循环状态EO的主要来源［8］。新近Schneider等［11］直接从牛肾上腺组织内分离出哇巴因样物质，为EO来源于肾上腺提供了直接证据。本研究同时发现下丘脑、垂体及肾上腺内的EO含量均明显增加，推测EO的分泌可<
