［摘要］目的：观察p21^WAF1在高糖作用下腹膜间皮细胞肥大中的作用。方法：用RT-PCR和Western Blot法测定在高浓度葡萄糖(含糖为1.38%、3.86%)作用24 h后体外培养的大鼠腹膜间皮细胞p21^WAF1水平；用流式细胞仪分析细胞周期分布。结果：高糖作用24 h后大鼠腹膜间皮细胞大多出现细胞肥大和停滞于细胞周期的G1期，以含糖3.86%组明显。p21^WAF1 mRNA和蛋白随着糖浓度增高表达增高(含糖组间P＜0.05)。在和含糖组相同渗透压的甘露醇组和无血清常规培养基几乎无p21^WAF1 mRNA和蛋白的表达。结论：p21^WAF1可能在高糖作用下间皮细胞的肥大及G1期阻滞中起重要的调节作用。

［中图分类号］R692.5； R329.2^＋4； Q253［文献标识码］A

［文章编号］1000-4718(2000)09-0788-04

Effect of cell cycle regulator p21^WAF1 on hypertrophy

of peritoneal mesothelial cells

YANG Qiong-qiong, YE Ren-gao, YU Xue-qing, XU Han-shi, YANG Xiao, KONG Qing-yu

(Department of Nephrology, 1^st Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University of Medical Sciences,

Guangzhou 510080, China)

［Abstract］AIM: To investigate the effect of cell cycle regulator p231^WAF1 on hypertrophy of peritoneal mesothelial cells affected by high concentrated glucose. METHODS: RT-PCR and Western Blot method were used to detect p21^WAF1 expression of rat peritoneal mesothelial cells in high glucose concentration medium (containing 1.86%, 3.86% glucose) after 24 hours. Flow cytometer technique was used to analyze the cell cycle distribution. RESULTS: In high glucose medium, most of the cells became hypertrophy, and were arrested in G1 phase of the cell cycle, which was obvious in 3.86% glucose group. Glucose increased p21^WAF1 mRNA and protein expression in a dose-dependent manner, and the levels of p21^WAF1 mRNA and protein in 3.86% glucose group were higher than those in 1.38% glucose group (P＜0.05). p21^WAF1 mRNA and protein expression were absent in the serum-free normal medium and D-mannitol groups which had the same osmolarity as the glucose groups. CONCLUSION: p21^WAF1 may be pivotal in the hypertrophy and arrest in the G1 phase of mesothelial cells induced by high concentrated glucose.

［MeSH］Peritoneal dialysis; Hypertrophy; Cell cycle; Proteins; Glucose

腹膜间皮细胞是构成腹膜的重要的细胞群体，它在保持腹膜结构的完整性和功能的有效性中起重要作用。许多体内外研究和临床研究都发现腹膜长期暴露于含糖(1.5%-4.25%)透析液中间皮细胞会出现细胞肥大的现象^［1-3］。近期研究发现肥大的间皮细胞可能是间皮细胞早期衰老的表现^［2，3］，并可能最终导致腹膜间皮细胞凋亡、腹膜间皮层缺失，使得腹膜对感染和纤维化的防御功能受损，导致腹膜纤维化及功能进行性丧失。但是目前关于腹膜间皮细胞肥大的机制仍未明。近期研究发现细胞周期抑制蛋白p21^WAF1的过度表达与细胞的肥大有关^［4-7］。是否腹膜间皮细胞的肥大与p21^WAF1有关，至今尚未有报道。本文应用RT-PCR和Western Blot方法，观察高糖对体外培养的大鼠腹膜间皮细胞p21^WAF1表达的影响，旨在从细胞周期角度探讨有关腹膜间皮细胞肥大的分子机制。

材料和方法

一、大鼠腹膜间皮细胞的分离、培养与鉴定

大鼠腹膜间皮细胞的培养按Hjelle等^［8］建立的方法操作。融合后间皮细胞呈铺路石样，传代后用抗大鼠cytokeritin、抗大鼠vimentin和抗Ⅷ因子相关抗原的单克隆抗体(美国Dako公司)用免疫组化方法(采用SP试剂盒，北京中山公司)鉴定细胞，结果抗cytokeritin和抗vimentin抗原阳性，抗Ⅷ因子相关抗原阴性。

二、高糖对间皮细胞形态及细胞周期的影响

将大鼠腹膜间皮细胞消化后制成细胞悬液接种于6孔培养板中，每孔10⁷，37℃孵育24 h后加入无血清培养基，同步化培养24 h后分别加入含不同的高浓度葡萄糖(1.38%，3.86%)的培养基培养24 h。每个浓度组设一个与高糖组相同渗透压的甘露醇组(浓度约为1.38%，3.86%)为对照组，另设常规的无血清培养基为空白对照组。培养结束后先在倒置显微镜下观察细胞形态并拍照。PBS冲洗后用0.125%胰蛋白酶轻消化，离心弃上清，PBS洗后70%乙醇4℃固定过夜。次日用PBS洗脱乙醇，制成单细胞悬液。PI染色后用流式细胞仪(美国Coulter公司)分析，并以相对细胞数为Y轴，相对的DNA量为X轴作一曲线。细胞周期G1期的细胞数百分比从图中通过电脑分析得出。

三、间皮细胞RNA提取及RT-PCR方法检测p21^WAF1 mRNA表达

10⁷腹膜间皮细胞在不同条件培养基培养24 h(条件同上述)后，用胰酶消化细胞并收集于无RNA酶的1.5 mL离心管中。用RN_easy Mini Kit(美国基因公司)一步法提取细胞总RNA。用紫外分光光度计测定总RNA的纯离和浓度，重复3次。样品OD_{260 nm}/OD_{280 nm}比值在1.8～2.0之间。以血管紧张素Ⅱ刺激24 h后的肾小管上皮细胞为阳性对照^［7］。第一链cDNA合成采用THERMOSCIPT^TM逆转录试剂盒(美国Gibco BRL)，按试剂盒说明进行。PCR扩增：取反转录后所得的cDNA模板2 μL，依次加入10×PCR缓冲液5 μL、2.5 nmol/L dNTP混合物5 μL、10 μmol/L上游及下游引物各1 μL和Taq DNA聚合酶(美国Promega公司)2 μL，总反应体积为50 μL。PCR反应所需的变性，退火和延伸温度为94℃、61℃、72℃，反应时间45 s、 45 s、 1 min，共循环30次。反应完成后，取15 μL反应液在2%琼脂糖凝胶(含0.2 mg/L EB)电泳分析。电泳完毕后在紫外灯下用凝胶成像系统成像及分析，三磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)为内参照，计算每一样本的p21^WAF1/GAPDH PCR扩增产物的相对比值。

引物设计和合成

p21^WAF1(301bp)^［9］

上游引物AGTATGCCGTCGTCTGTTCG

下游引物GAGTGCAAGACAGCGACAAG

GAPDH(230bp)

上游引物ACCACAGTCCATGAAATCAC

下游引物AGGTTTCTCCAGGCGGCATG

四、Western blot法检测p21^WAF1蛋白表达

10⁷腹膜间皮细胞在不同条件培养基培养24 h(条件同上述)后，用细胞裂解液(62.5 mmol/L Tris-HCl(pH6.8, 25℃)，2% W/V SDS， 10% glycerol, 50 mmol/L DTT)提取蛋白。蛋白浓度的测定采用Bradford法。取总蛋白50 μg(用细胞裂解液将各样本调至5 g/L)，100℃煮沸5 min, 12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离蛋白。电泳结束后，将蛋白转印到PVDF膜(Boehringer Mannheim)。转膜结束后，用5% TBST封闭60 min，加入稀释好的Ⅰ抗(Rabbit polyclonal anti-p21 Ab: Santa Cruz Cat No: Sc-756工作浓度1∶200)，室温振荡60 min， 1×TBST 40 mL洗6-8次×5 min。此后按luml-light^plus免疫印迹发光试剂盒(Cat No: 2015218, Boehninger Mannheim)说明书操作，X光片在IBAS2.5图像分析系统进行光密度分析。

五、统计学处理

结果以均数±标准差(±s)表示，两组之间差异的显著性以F检验和Q检验作统计学处理。

结果

一、高糖对大鼠腹膜间皮细胞细胞周期数及形态的影响

在倒置显微镜下可观察到大鼠腹膜间皮细胞在高糖的培养条件出现两种明显的形态学改变，首先是细胞肥大，胞核与胞浆成比例，核仁明显，呈“牛眼”征；其二是可见许多细胞的胞核增多，细胞分裂停止(见图1，见加页Ⅰ)。以上改变在含糖浓度为3.86%组中更为明显。而在甘露醇组仅有轻度细胞肥大。

流式细胞仪分析细胞周期分布(见表1)，可发现在含糖1.38%和3.86%组G1期细胞比例明显高于对照组(P＜0.05)，但含糖组间无显著差异。含甘露醇1.38%、3.86%组G1期细胞比例与对照组相比无显著差异。

ig.1 The morphology change of rat mesothelial cells cultured n teh 3.86%glucose

medium for 24 h (B)

A:normalrat mesothelial cells (HM×100)

1含 糖浓度为3.86%组大鼠腹膜<