［摘要］目的：探讨抗鼠补体C5b-9复合物抗血清对系膜增生性肾炎大鼠肾组织合成一氧化氮(NO)及其病变的作用。方法：复制大鼠系膜增生性肾小球肾炎即抗胸腺细胞血清性肾炎(ATSN)模型，用抗大鼠C5b-9复合物抗血清处理，观察其对ATSN大鼠NO相关指标及其病变的影响。结果：抗鼠C5b-9复合物抗血清既能减少ATSN大鼠肾组织诱生性NO合酶(iNOS)mRNA的表达和大鼠尿液中硝酸盐／亚硝酸盐(NO^-₃／NO^-₂)排泄量，还能减低大鼠肾组织病变的程度。NOS抑制剂L-NAME也可降低尿NO^-₃/NO^-₃排泄量，同时减轻肾组织病变程度。结论：抗鼠C5b-9复合物抗血清能够抑制肾细胞NO的合成及其肾小球系膜细胞的增生。

［中图分类号］R692［文献标识码］A

［文章编号］1000-4718(2000)09-0805-04

Effect of antiserum against complement C5b-9 complexes on

nitric oxide(NO) synthesis and pathologic changes

in renal tissue of ATSN rats

WANG Ying-wei, GAO Feng-guang, TANG Ren-xian

(Department of Immunology,Xuzhou Medical college,Xuzhou 221002, China)

HE Qiu-zao, QIN Hui-lian

(Department of Immunology, Shanghai Medical University, Shanghai 200032, China)

［Abstract］AIM: To explore the effect of antiserum against rat complement C5b-9 complexes on nitric oxide synthesis and pathologic changes in renal tissue of rats with mesangioproliferative glomerulonephritis. METHEDS: The rat model of mesangioproliferative glomerulonephritis,namely,anti-thymocyte serum nephritis(ATSN) was established and the rats with ATSN were treated with antiserum against complement C5b-9 complexes. Some parameters related to NO and pathologic changes of the rats were observed.RESULTS:Anti-C5b-9 serum not only reduced the expression of inducible NO synthase(iNOS) mRNA in renal tissue and urinary content of nitrate/nitrite(NO^-₃/ NO^-₂) of rats with ATSN, but also reduced renal pathologic changes. L-N^G-nitro arginine methylester (L-NAME) also reduced the contents of urinary NO^-₃/NO^-₂ and the renal pathologic changes of rats with ATSN. CONCLUSION:The antiserum against rat complement C5b-9 complexes inhibited glomerular NO synthesis and glomerular mesangial cell proliferation of rats with ATSN.

［MeSH］Complement membrane attack complex; Glomerulonephritis, membranoproliferative; Nitric oxide;Rats

大鼠抗胸腺细胞血清性肾炎(anti-thymocyte serum nephritis,ATSN)是人类系膜增生性肾炎的动物模型之一^［1］。近年来的研究证明：ATSN的病变具有补体依赖性及中性粒细胞非依赖性^［2］。亚溶解(sublytic)剂量的补体膜攻击复合体即C5b-9复合物在插入靶细胞膜后能够激活胞内多种代谢途径，致使一些生物活性介质释放，引起炎症病变和增生反应^［3］。我们过去的实验已提示，一定量的C5b-9复合物能刺激体外培养的大鼠肾小球系膜细胞(mesangial cell, MC)合成一氧化氮(nitric oxide,NO)。本文旨在观察体内应用抗鼠C5b-9复合物抗血清处理ATSN大鼠后其肾组织诱生性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS) mRNA的表达、尿液中NO代谢产物——硝酸盐(nitrate, NO^-₃)和亚硝酸盐(nitrite, NO^-₂)排泄量及肾小球的病理变化，以了解C5b-9抗血清对ATSN大鼠肾组织NO合成及其病变程度有何影响。

材料和方法

一、大鼠血清补体C5b-9复合物的提取及其抗血清的制备见参考文献^［4］。

二、大鼠胸腺细胞的分离及其抗血清的制备操作方法见文献^［5］。

三、大鼠ATSN模型的复制及其分组处理

取正常雌性SD大鼠32只(本实验动物中心提供)，重160-210 g。实验前先行尿蛋白测定，查无异常后随机分成4组，每组8只。(一)ATSN模型组：首次给大鼠尾静脉注射抗胸腺细胞血清(anti-thymocyte serum,ATS) 0.5 mL/100 g体重，然后每隔7 d再给大鼠注射ATS(0.5 mL/100 g)1次，共3次。(二)ATSN+Anti-C5b-9抗血清组：每次给大鼠静脉注射同(一)组的ATS后再静脉注射兔抗鼠C5b-9抗血清(0.5 mL/100 g)。(三)ATSN+L-NAME组：每次给大鼠静脉注射同(一)组的ATS后再静脉追加注射N^G-硝基-L-精氨酸甲基酯(L-N^G-nitro arginine methylester,L-NAME)，剂量为0.5mg/100g体重。（四）对照组：首次给大鼠静脉注射正常兔血清(剂量同ATS)后，每隔7 d再给大鼠注射生理盐水1次。

四、检测指标

(一)点杂交(Dot-blot)测定肾组织iNOS mRNA的表达与丰度

用TRIZOL试剂(美国GIBCO公司)分别提取各组大鼠实验3、7 d和14 d活检的肾皮质总RNA，然后各取10 μg点在尼龙膜(德国B.M.公司)上，先预杂交42 ℃ 4 h，然后再用地高辛(digoxigenin,DIG)标记的大鼠iNOS cRNA探针^［6］杂交，42 ℃ 16 h最后经DIG核苷酸检测试剂盒(B.M.公司)显色观察。

(二)原位杂交检查肾切片iNOS mRNA的表达

实验3 d、14 d取大鼠肾皮质行快速石蜡包埋，并制成7 μm厚切片，切片经梯度乙醇脱水、蛋白酶K(B.M产品)消化及PBS洗涤处理后，用DIG-iNOS cRNA探针进行预杂交、杂交，杂交时间及显示系统材料等均同Dot-blot检测。

(三)尿液中NO^-₃／NO^-₂排泄量的测定

实验3 d、7 d、14 d及28 d分别将各组大鼠置代谢笼内，收集其24 h全部尿液，并测量尿液体积。采用硝酸还原酶法测定各鼠24 h尿液中NO的代谢产物NO^-₃／NO^-₂的排泄量，试剂盒购于南京建成生物工程研究所。结果以nmol/24 h尿液表示。

(四)肾小球内细胞总数的变化

实验3 d、7 d、14 d和28 d活检各组大鼠肾皮质标本制成石腊切片(HE染色)，每个标本每张切片随机计数20个肾小球内细胞数，最后取均值比较。

(五)肾小球内α-SMA的表达

同上时间活检的各组大鼠肾皮质制成冰冻切片(4 μm厚)后，用单克隆抗平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)抗体(DAKO公司)为一抗行ABC法染色检查各鼠肾小球内α-SMA的表达情况。α-SMA半定量分析采用德国MD-20型显微图像分析仪［分辨率：4×面积＝象素点×(0.0025 )² mm］扫描测定。每张切片上随机取20个肾小球测定其平均积分光密度(OD)值，各组OD值取均数比较。

(六)肾小球系膜区的改变

各组大鼠肾皮质石腊切片HE染色(取材时间同上)标本，显微镜下观察肾小球系膜区细胞数及肾小球系膜区基质等病理变化。

结果

一、Dot-blot检测肾组织iNOS mRNA的结果

实验3 d、7 d和14d时，ATSN模型组肾组织中均有明显的iNOS mRNA表达，而ATSN+Anti-C5b-9组实验3 d、7 d和14 d时，iNOS mRNA虽有表达，但丰度不如ATSN模型组高。另ATSN+L-NAME组，肾组织iNOS mRNA表达亦较显著，而正常对照组无iNOS mRNA的表达。结果见图1。

二、原位杂交检测肾细胞iNOS mRNA的表达情况

实验3 d，ATSN模型组肾组织切片显示肾小球系膜细胞有明显的iNOS mRNA表达(图2)，而ATSN+Anti-C5b-9组肾小球系膜细胞表达iNOS mRNA量较少。此外，ATSN+L-NAME组，肾组织切片iNOS mRNA表达亦较明显。对照组无iNOS mRNA的表达。

三、尿液中NO^-₃／NO^-₂的排泄总量

实验各阶段，ATSN+Anti-C5b-9组大鼠24 h尿液中NO^-₃／NO^-₂排泄量均明显较ATSN组低，具体数据详见表1。

Fig 1 The expression of renal tissue iNOS mRNA in four groups of rats by Dot-blot.

A. ATSN; B. ATSN+Anti-C5b-9; C. ATSN+L-NAME; D. Control.

1点杂交显示4组大鼠肾组织iNOS mRNA的表达