［摘要］目的： 研究cAMP、cGMP在心肌细胞碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因表达调节中的作用。方法： 分离培养大鼠心肌细胞，加入8-溴-cAMP和硝普钠，升高细胞内cAMP、cGMP浓度，用原位杂交及免疫细胞化学的方法观察细胞内bFGF的表达，图象分析检测bFGF表达量的变化。结果： 在培养中加8-溴-cAMP的心肌细胞，24 h时bFGF mRNA及蛋白表达均明显高于对照组，48 h、72 h仍然较强表达(P＜0.05)。而加硝普钠的心肌细胞，bFGF表达明显低于对照组，以48 h最为显著（P＜0.01）。结论： cAMP、cGMP可能与心肌细胞bFGF的表达调节有关。

［中图分类号］Q344^＋.14； R542.2［文献标识码］A

［文章编号］1000-4718(2000)09-0818-03

Role of cAMP and cGMP in the regulation of bFGF gene expression

of rat cardiomyocytes

LUO Hui-lan, HE Zuo-yun, FENG Bing， DU Shu-ping， QI Wen-feng， AN Yong-qing

(Department of cardiology, Xinqiao Hospital, Third Military Medical college, Chongqin 400037， China)

［Abstract］AIM： To investigate the role of cAMP and cGMP in the regulation of bFGF gene expression of rat cardiomyocytes. METHODS: 8-Bromo-cAMP and sodium nitroprusside were added into the media to raise the concentrations of cAMP and cGMP of cultured cardiomyocytes, in situ hybridization and immunohistochemistry methods were used to identify the mRNA and protein expression of bFGF. The amount of bFGF mRNA and protein expression were detected by computor imaging analysis system MIAS exe. RESULTS: At 24 h after adding 8-Bromo-cAMP(0.1 mmol/L), bFGF mRNA and protein expression elevated significantly , at 48 h and 72 h it still expressed higher than that of control group(P＜0.05). But after adding sodium nitroprusside (1 mmol/L),bFGF expression decreased significantly,and especially at 48 h. CONCLUSION; The regulation of bFGF expression of cardiomyocytes is related to cAMP signal pathway.

［MeSH］Nucleotides, cyclic; Fibroblast growth factor, basic; Myocardium; Cells

在高血压病心肌肥大的发病学中，血液动力学作用最早为人们所重视，目前认为心脏主要是通过增加心肌细胞的蛋白质合成、诱导细胞肥大来适应急慢性血液动力学改变。业已证明，压力超负荷可使心肌细胞内cAMP浓度升高、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）基因表达及向细胞外分泌^［1-5］。体外实验提示, bFGF可刺激心肌细胞c-fos等极早期应达基因表达、显著增加蛋白质合成，并最终诱导心肌细胞肥大^［6］。但是，压力超负荷时bFGF基因表达的机制目前尚不清楚，本实验拟观察cAMP、cGMP在心肌细胞bFGF基因表达调节中的作用。

材料和方法

一、心肌细胞原代培养

新生Wistar大鼠（2 d以内），无菌操作下取出心脏，剪除外膜及心房，将心室肌放于0.1%胰蛋白酶中剪碎后置4℃冰箱消化1 h，离心，加入培养液M199（含10%小牛血清）制成细胞悬液，以差速贴壁法获取心肌细胞，接种至96孔板或盖玻片（放于12孔板中），37℃ CO₂温箱中培养，24 h后开始见细胞搏动，4 d时，细胞基本融合，用于实验。

二、实验分组

将培养细胞分为对照组、cAMP组、硝普钠(sodium nitroprusside)(NO供体，升高心肌细胞内cGMP

浓度)组，无血清培养24 h后，cAMP组加入8-溴-cAMP(0.1 mmol/L，购自宝灵曼公司)，硝普钠组加入硝普钠（1 mmol/L，北京医科大学病理教研室赠），各组分别于30 min、3 h、24 h、48 h、72 h 5个时点测定细胞生长代谢活性（96孔板，MTT法 用酶标仪测定波长570nm处的OD值），同时用1%多聚甲醛及70%乙醇固定细胞（12孔板），-20 ℃冰箱保存。

三、bFGF原位杂交和免疫组织化学检测

按常规免疫组织化学技术程序操作检测心肌细胞内bFGF蛋白表达水平，原位杂交技术检测细胞内bFGF mRNA表达改变。bFGF探针长度为 0.5 kb，bFGF cDNA、抗体及SP试剂盒均购自北京中山生物技术公司，地高辛标记及检测试剂盒购自宝灵曼公司。每组取3张盖玻片细胞作免疫组化或原位杂交染色，重复3次实验。

四、图像分析

用北航医学图像分析管理系统Mias exe作相对定量分析（积分光密度）。

五、统计方法

实验结果以±s表示，采用裂区方差分析进行差异显著检验。

结 果

一、cAMP、cGMP对细胞生长代谢的影响

图1可以看出在培养的心肌细胞中加入8-溴-cAMP，细胞生长代谢较对照组明显活跃（P＜0.01），药物与时间交互效应无显著性差异。而硝普钠组细胞24 h后生长代谢明显受到抑制（P＜0.01），药物与时间交互效应也无显著差异。

Fig 1 Growth curves of cultural cardiocytes. ±s. n=12.

^*P＜0.05, ^** P＜0.01 vs control.

1cAMP、硝普钠对培养心肌细胞生长的影响

二、心肌细胞bFGF表达特点

在培养心肌细胞，bFGF mRNA及蛋白均有弱阳性表达，bFGF 蛋白主要分布于细胞浆及细胞膜。加入cAMP后，bFGF mRNA及蛋白阳性表达的细胞数及染色强度均明显增加和提高，而硝普钠（cGMP）明显抑制bFGF的表达（图2、图3，见加页Ⅱ）。

三、心肌细胞bFGF表达的定量分析

图4可以看出培养细胞中加入8-溴-cAMP后bFGF蛋白水平的表达明显高于对照组，药物效应、时间效应、药物与时间交互效应均有显著差异（P＜0.05）。加入硝普钠（cGMP增高）组bFGF蛋白水平表达明显少于对照组，药物效应、时间效应、药物与时间交互效应有显著性差异（P＜0.05）。 图5可以看出升高细胞内cAMP浓度，bFGF mRNA表达明显高于对照组（P＜0.01）。升高细胞内cGMP 浓度，bFGF mRNA表达明显低于对照组（P＜0.01），尤以48 h明显。

Fig2 Basic fibroblast growth factor protein levels in cardiomyocytes (×4000)

A:control;B:cAMP group;C:sodim nitroprusside group

2心肌细胞bFGF蛋白质水平（A：对照组：B：环一磷酸腺苷组；C：硝普钠组）

Fig3 Basic fibrolast growth factor mRNA expression in cardiomyocytes (×400)

A:control ;B:cAMP group;C:sodium nitroprusside group

3心肌细胞中bFGF mRNA 的表达（A：对照组；B：环一磷酸腺苷组；C：硝普钠组）

Fig 4 Image analyze of basic fibroblast growth factor protein expression.±s. n=5.^*P＜0.05,^** P＜0.01 vs control.

4bFGF蛋白表达的定量分析

Fig 5Image analyze of basic fibroblast growth factor mRNA expression. ±s. n=5.^*P＜0.05, ^**P＜0.01 vs control.

5bFGF mRNA表达的定量分析

讨 论

Singh首先研究发现，牵张离体蛙心室可诱发心肌细胞内cAMP浓度迅速升高。使用停搏心脏避免了心肌收缩活性对蛋白合成的影响，因此，Xenophonose等发现，用高压力灌注停搏心脏仍能诱导心肌内蛋白激酶