［摘要］ 目的：为制备重组人CD154-谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融合蛋白（hCD154 -GST），用于人CD154单克隆抗体研制。方法：根据人CD154基因序列设计合成特异性引物，RT-PCR扩增人CD154基因，并插入融合蛋白原核表达载体pGEX-4T-1中，得到重组表达质粒pGEX-4T-1/CD154；用此重组质粒转化大肠杆菌BL21细胞，转化菌落经BamH Ⅰ、EcoRⅠ酶切鉴定。IPTG诱导大肠杆菌表达人CD154蛋白，SDS-PAGE电泳鉴定表达产物。结果：从人外周血淋巴细胞扩增出820bp的hCD154 cDNA；将其克隆至pGEX-4T-1质粒中，经双酶切鉴定及DNA序列分析证实含有目的基因；IPTG诱导后的大肠杆菌经 SDS-PAGE电泳鉴定出现明显的55kD蛋白带。 结论：成功构建了人CD154-GST原核表达质粒，并在大肠杆菌中表达出人CD154-GST融合蛋白，为人CD154单克隆抗体的研制及进一步抗排斥反应的研究打下了基础。

［中图分类号］ Q754 ［文献标示码］ A

［文章编号］1000-4718(2000)08-0673-05

Cloning of hCD154 gene from human activated peripheral

blood mononuclear cell and expression of hCD154-GST

fusion protein in prokaryote

ZHANG Chun-yan，NING Bo，CAO Kai-yuan

(Department of ImmunologyGuangzhou 510089, China)

LI Shu-nong

(Department of PathphysiologyGuangzhou 510089, China)

ZHANG Zhi-fang

(Department of Physiology,

Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510089, China)

［Abstract］ AIM：To express recombinant hCD154-GST fusion protein, to prepare anti-hCD154 monoclonal antibody, and to investigate the effect of anti-hCD154 monoclonal antibody on graft rejection. METHODS AND RESULTS: Total RNA was prepared from human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) activated with 10ng/mL PMA and 1 μg/mL PHA for 8h, the total RNA was reversetranscribed to cDNA. The entire coding region and a part of the 3'non-coding regions were amplified by PCR using a pair of primers designed and synthesized according to the sequence of human CD154 gene from gene bank. The amplified product, a 820bp DNA fragment was cloned into pGEX-4T-1 plasmid expressing glutathione S-transferase(GST). The cloned insert was identified by double digestion of the cloned pGEX-4T-1 plasmid with retriction enzymes BamHⅠand EcoRⅠ.The fusion protein expression plasmid of PGEX-4T-1/hCD154 was constructed, then transformed to E coli BL21. The human CD154-GST fusion protein expression was induced by IPTG in BL21. The expression of recombinant 26kD GST and 55kD human CD154-GST fusion protein were confirmed by SDS-PAGE. CONCLUSION: We have express the recombinant human CD154-GST fusion protein. The expressed hCD154-GST fusion protein will be used to prepare anti-hCD154 monoclonal antibody, to investigate the role of anti-CD154 monoclonal antibody on graft rejection.

［MeSH］ Human CD154; Fusion protein; Gene expression; Cloning, molecular

移植排斥反应发生的主要机制是T细胞介导的免疫应答。CD154是一种分子量为29～39 kD的II型跨膜糖蛋白，主要存在于激活的T细胞，它是CD40分子的配体。研究表明^［1，2］，在免疫应答过程中，T细胞上的CD154分子与抗原呈递细胞上的CD40分子结合，信号通过CD40分子传递，引起抗原呈递细胞上B7分子的表达，B7分子与T细胞上的CD28分子结合，为T细胞的活化提供第二信号。业已证明^［3，4］，CD154抗体可以阻断CD40与CD154分子的结合，使CD40信号传递中断，B7分子不能表达，T细胞缺乏第二活化信号，导致T细胞无反应性。因此，探讨CD154单克隆抗体抗移植排斥反应作用已成为移植免疫研究领域中的一个新的热点^［5，6］。我们构建全长的人CD154 cDNA原核表达质粒，表达人GST-CD154融合蛋白，为制备人CD154单克隆抗体，进而研制成新的免疫抑制剂打下基础。

材料和方法

一、 菌株和质粒

大肠杆菌BL21和DH5α为本实验室保存；pGEX-4T-1质粒为Pharmercia公司产品。

二、主要试剂

各种DNA限制性内切酶、T4DNA连接酶、TaqDNA聚合酶、标准分子量蛋白、均购自上海生工生物工程有限公司。RPMI1640细胞培养基购自GIBCO公司。其他常规化学试剂为分析纯以上产品。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

三、 人外周血淋巴细胞总RNA提取

自健康人外周血分离淋巴细胞，加入植物凝集素（phytohamagglutinin,PHA）1 μg/mL和佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate、PMA）10 ng/mL激活，37℃培养8 h后，收集培养细胞，按异硫氢酸胍一步法提取总RNA，紫外分光光度计定量^［7］。

四、 引物的设计和反转录PCR

根据基因库（GenBank, 登录号X67878.DNA）中人CD154（hCD154）基因序列，设计合成一对引物，5’端引物含有BamH I酶切位点和起始密码，3’端引物含有EcoR I酶切位点和终止密码。以提取的总RNA为模板，先逆转录合成cDNA第一链，然后进行常规PCR扩增，扩增条件：95℃变性60 s，55℃退火50 s，72℃延伸60 s，循环33次。取PCR产物5 μL在1.5%的琼脂糖凝胶中电泳，用紫外分析仪检测电泳结果。

五、 pGEX-4T-1/CD154表达质粒的构建

选用谷胱甘肽巯基转移酶（glutathione S-trabsferase,GST）融合蛋白表达载体pGEX-4T-1,将载体和PCR产物经BamH I和EcoR I双酶切后，从琼脂糖凝胶回收酶切产物，T4连接酶连接反应18℃, 16 h，构建重组质粒pGEX-4T-1/CD154。

六、 大肠杆菌的转化及重组质粒的酶切鉴定

制备感受态的大肠杆菌BL21细胞，加重组质粒和对照质粒置冰浴30 min，40 ℃热休克90 s，再放冰上2 min；转入LB培养基中，37 ℃ 45 min摇菌培养后，将菌液铺于含有氨苄青霉素的LB固体培养基上，37 ℃过夜，次日观察菌落，并挑取6个菌落培养后，提取质粒经BamH I和EcoR I双酶切，通过限制性内切酶图谱分析和PCR扩增，鉴定感受态细胞是否插入目的基因^［8］。

七、 重组质粒DNA序列测定

取经鉴定含有目的基因的重组质粒进行序列分析。

八、 人CD154-GST融合蛋白的诱导表达

分别将含有pGEX-4T-1/CD154质粒和pGEX-4T-1空载体的菌株放入氨苄青霉素2×YTG培养基中37℃过夜摇菌培养，次日按1：100稀释培养过夜的菌液转种，培养2h，菌液OD₆₀₀=0.4～0.6时，加入异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside, IPTG）至终浓度为0.2 mmol/L,未加IPTG诱导的菌液作为对照，继续培养，分别于2 h和4 h，离心收集菌体进行SDS-PAGE分析。

结 果

一、 RT-PCR扩增hCD154 cDNA

PCR产物的电泳结果表明，所扩增的目的基因片段与预期的一致，为820bp (图1)。

Fig 1 Agarose gel electrophoresis map of PCR products

M: 1 kb DNA ladder

1. PCR products with recombinant plasmid

2. RT-PCR products

1PCR产物凝胶电泳

二、pGEX-4T-1/CD154重组质粒的构建和酶切鉴定

pGEX-4T-1载体和PCR产物经BamH I和EcoR I双酶切，从琼脂糖凝胶回收酶切产物，经T4连接酶连接，连接产物转化后的大肠杆菌BL21铺于含氨苄青霉素的LB平板，37℃过夜，次日观察到pGEX-4T-1/CD154质粒转化菌较稀疏地均匀分布在平板上，分别取pGEX-T-1/CD154和pGEX-4T-1质粒转化菌进行扩增后，抽提质粒DNA进行酶切鉴定，经0.1%的琼脂糖凝胶电泳，可见经BamH I和EcoR I双酶切后，成为两个片段，分别为4.9kb的pGEX-4T-1和820bp的人CD154基因片段,与理论值相符（图2）。

Fig 2 Restriction map of recombinant plasmid

M: 1 kb DNA ladder

1.RT-PCR products

2.Expression plasmid pGEX-4T-1/CD154 digested by B