［摘要］目的：了解外源性碳源物对心肌氧化磷酸化动态调节的影响。方法：采用Van Beek建立的心肌线粒体平均氧耗反应时间（t_mito）测定方法，以葡萄糖、乳酸和丙酮酸分别为心肌供能的碳源物，用37℃的Tyrode液灌流离体兔心脏进行实验。结果：心率由120分别增至140和220（min^-1）。测得的t_mito：葡萄糖为(6.3±1.0) s和(7.4±0.9) s；乳酸为(5.4±1.2) s和(7.0±0.9) s；丙酮酸为(4.0±0.7) s和(6.5±0.6) s (tow-way ANOVA,P＜0.05，与葡萄糖，乳酸比较)。结论：心肌线粒体氧化磷酸化在心肌ATP利用快速变化的动态适应过程中，还原当量向线粒体内的转运可能是动态适应的限速因素。

［中图分类号］ R331.3⁺1［文献标识码］A

［文章编号］1000-4718(2000)08-0685-05

The effect of glucose, lactate and pyruvate on the dynamic

adaptation of cardiac mitochondrial oxygen consumption

TIAN Xin-qiang

(Department of Pathophysiology, Datong Medical College, Datong 037008, China)

［Abstract］ AIM: To understand the effect of exogenous carbon substrate on the dynamic regulation of cardiac oxidative phosphorylation. METHODS: Method of mean response time measurement of the myocardial mitochondrial O₂ consumption (t_mito) was developed by van Beek. Glucose, lactate, or pyruvate as carbon substrate respectively for myocardial energy supply was perfused in isolated rabbit hearts with Tyrode solution at 37℃. RESULTS: When heart rate was stepped up from 120 to 140 and 220 (beat·min^-1) respectively the t_mito. We have measured was: （6.3±1.0）s and (7.4±0.9) s for glucose; (5.4±1.2) s and (7.0±0.9) s for lactate; (4.0±0.7)s and (6.5±0.6) s for pyruvate (two way ANOVA, P＜0.05, compared with lactate and glucose). CONCLUSION: The transport of reducing equivalent into the mitochondrial matrix might be a limitation factor of dynamic adaptation of cardiac mitochondrial oxidative phosphorylation during fast changes in ATP utilization.

［MeSH］ Myocardium; Mitochondria; Oxidative phosphorylation; Glucose; Lactates; Pyruvates

外源性碳源物的类型对作功处于稳定状态的心肌氧化磷酸化水平有明显的影响^［1］。当葡萄糖为外源性碳源时，细胞内二磷酸腺苷（adenosine diphosphate, ADP）和无机磷酸（inorganic phosphate, Pi）的水平较高，而进入线粒体呼吸链的还原当量对氧化磷酸化起相当重要的限速控制作用^［2］。当丙酮酸为外源性碳源物时，心肌细胞线粒体内还原型尼可酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide, NADH）的水平增高^［3］，而ADP水平较低。外源性碳源物对心肌线粒体氧化磷酸化动态适应的影响还知之甚少。在骨骼肌，当三磷酸腺苷（adenosine triphosphate, ATP）消耗增加时，其线粒体ATP合成的适应速度是恒定的^［4］，氧化磷酸化的变化是由磷酸化合物代谢水平的变化所引起的。然而，用葡萄糖灌流离体兔心脏，在较大的心率变化时，心肌氧化磷酸化对ATP分解的适应速度降低^［5］。假若其适应速度降低是由于葡萄糖为氧化底物时，心肌线粒体内的尼可酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide, NAD⁺）水平降低起了部分限速作用^［5］。由此提出糖酵解或还原当量的转运是否是氧化磷酸化适应过程的限速因素。本研究采用Van Beek 建立的心肌线粒体平均氧耗反应时间测定方法^［6］，试图了解不同外源性碳源物对心肌氧化磷酸化动态适应的影响。

材料和方法

一、一般准备

新西兰兔（n=12）雌雄不限，体重(2.6±0.2) kg(±s)，肌注氟丁酰酮(9.8±0.3) mg/kg和芬太尼（hypnorm; Janssen Pharmaceutica, Beerse, Belgium）(0.38±0.01) mg/kg麻醉动物，静注苯巴比妥钠10 mg/kg和肝素2 500 IU，开胸，取出心脏，按照Langendoff 方法灌流心脏。以37℃的Tyrode液作为灌流液，95% O₂ 和5% CO₂ 气体充分饱和。腺苷（Sigma, St. Louis, MO）10^-5 mol/L作为冠脉血管舒张剂加入灌流液中以保证心肌最大的灌流量。以11.1 mmol/L的葡萄糖、乳酸和丙酮酸分别为心肌供能的碳源物质。离体心脏准备详见van Beek等的报道^{［5, 6］}。

二、灌流装置

采用恒流恒温灌流系统。两个Clark type氧电极分别置于心脏的主动脉和肺动脉插管测定灌流液氧分压。一灌流旁路装置可使约10%的灌流液转为由95% N₂和5%CO₂饱和的灌流液，使灌流液氧浓度突然降低（arterial oxygen concentration step, ACS）；或使约10%的灌流量突然减少（perfusion flow step, PFS）；ACS和PFS用于测定氧从心肌血管至线粒体内的运输时间（t_transport）。所有测量结果数字化储存在PC计算机中，作数据分析处理。详见Van Beek 等的报道^{［5, 6］}。

三、心肌线粒体平均氧耗反应时间（the mean response time of myocardial mitochondrial oxygen consumption, t_mito）

当心率突然增加时，心肌内ATP水解即刻增加；继而线粒体的生物氧化水平增高，心肌氧耗也随之增加；已知心肌内90%的ATP来自线粒体的生物氧化过程，测定心脏静脉氧分压变化的时间过程，可得知心肌线粒体氧耗反应的适应速度，被定义为心肌线粒体平均氧耗反应时间（t_mito）^［6］。t_mito可按公式 t_mito=t_v-t_transport得出。该公式数学上的精确定义和推导参见Van Beek^［6］的报道。t_v表示心率增快后的静脉氧分压变化反应时间，由置于肺动脉插管的氧电极测得的静脉氧分压变化以时间作定积分计算得出；t_transport表示氧从心肌血管至线粒体内的运输时间，可从ACS或PFS测得的静脉氧分压变化反应时间计算得出。

四、分组及实验步骤

由于离体兔心脏用37℃Tyrode液灌流超过120 min以上时，心肌收缩将明显降低，故将实验分为两组。Ⅰ组（n=6）：Tyrode液中分别加入11.1 mmol/L葡萄糖和11.1 mmol/L丙酮酸灌流心脏。Ⅱ组(n=6)：灌流液中分别加入11.1 mmol/L葡萄糖和11.1 mmol/L乳酸灌流心脏。实验过程时间表和碳源物灌流顺序见图1。约经30 min后，每种碳源物分别测定3个指标，即：①心率变化（heart rate step, HRS）时的静脉氧分压变化反应时间，由基础心率120次·min^-1增加至140、160、190、220次·min^-1，每次均返回至基础心率120次·min^-1；②实施ACS和PFS，用于测定氧在心肌中的运输时间；③灌流白蛋白-伊文思蓝液（evans blue steps, EBS），用于测定心肌血管的容量，以计算氧运输时间。 ②，③两项均在心率120 和220次·min^-1分别予以测定。每次转换为第二种碳源物后，需经15 min平衡时间，使左心室压稳定后，表示心肌代谢达到稳定。

Fig 1Time table of the experimental protocol. Exision of the heart occurs at t=0

During each series of measurements several interventions (HRS, ACS,PFS and eBS, see method) were applied to determine t_mito. Substrate concentration used was 11.1 mmol/L. Eq: equilibration period

1不同碳源物灌流心肌的时间顺序表

所有数据均以均数±标准差（±s）表示。采用双因素方差分析（two-way analysis of variance, ANOVA）和t检验进行差异显著性检验。

结果

一、一般情况

在实验结束后即刻测心脏的湿重为(12.0±0.4) g (n=12)，经48 h、 60℃脱水干燥后测得的心肌干重为(1.6±0.1) g。心肌灌流量为(7.4±0.4) mL.min^-1.g^-1_{wet weight}。两组间的心脏干、湿重及心肌灌流量无明显差异；各组实验前后的心肌灌流量无明显差异（t-test, P＞0.05）。

二、左心室作功

3种碳源物的灌流过程中均出现左心室收缩压（left ventricular systolic pressure, LVSP）随心率的加快而逐渐下降（ANOVA，P＜0.05），结果见图2。各组内两种碳源物灌流时的LVSP无显著差异（P＞0.05）。

三、心肌耗氧量

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