［摘要］目的和方法：用MTT方法检测了急性淋巴细胞白血病(ALL)患儿骨髓基质细胞(BMSC)对正常骨髓造血细胞和淋巴瘤Raji细胞的粘附行为，用流式细胞仪检测了BMSC表面的粘附分子ICAM-1和VCAM-1的表达。结果：急性期组ALL BMSC对骨髓造血细胞的粘附能力明显下降。长期缓解组ALL BMSC对肿瘤细胞的粘附能力明显增高。急性期组ALL BMSC表面ICAM-1表达明显降低。结论：ALL患儿BMSC对骨髓造血细胞和肿瘤细胞的粘附行为的异常，BMSC粘附行为的变化与细胞表面粘附分子的表达异常有关。

［中图分类号］R733.7［文献标识码］A

［文章编号］1000-4718(2000)08-0713-05

Adhesion of bone marrow stromal cell in children with acute

lymphoblastic leukemia

HUANG Yun,LI Xiao-yu，LIN Sui-zhen，LUO Xue-qun，QIN Zhao-yuan¹

(Department of Pediatrics of The First Affiliated Hospital Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510080,

China)

LI Shu-nong

(Department of Pathophysiology, Sun Yat-sen University of Medical Science, Guangzhou 510089, China)

［Abstract］AIM and METHOD: The adhesion behavior of bone marrow stromal cells(BMSC) in children with acute lymphoblastic leukemia(ALL) to bone marrow mononuclear cells(BMMC) and Raji cells were investigated by MTT method. The expression of adhesion molecules ICAM-1 and VCAM-1 were detected by flow cytometry. RESULTS: The adhesion ability of BMSC in acute period of ALL to BMMC was lower than that of control group. The adhesion ability of BMSC in long term remission period of ALL to Raji cells higher than that of control group. The expression of ICAM-1 on the surface of BMSC in acute period of ALL is much lower than that of control group. CONCLUSIONS: The adhesion of BMSC to BMMC or tumor cells in children with ALL was abnormal. The abnormal adhesion behavior might be partially due to the changed expression of adhesion molecules on BMSC.

［MeSH］Leukemia, lymphoblastic, acute; Cell adhesion; Cell adhesion molecules

急性期骨髓造血抑制和缓解期微量残余白血病细胞所致的复发是影响白血病治疗的重要因素，但二者的发生机制还不明确，骨髓基质细胞(bone marrow stromal cell, BMSC)在其中的作用不清楚，我们检测了处于不同治疗阶段的急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)患儿BMSC对骨髓造血细胞和肿瘤细胞的粘附能力及其表面粘附分子ICAM-1(CD54)、VCAM-1(CD106)的表达，以探讨BMSC在白血病骨髓造血抑制和微量残余白血病细胞发生中的作用，促进白血病疗效的进一步提高。

材料和方法

一、病例选择和标本采集

ALL患儿20例，经骨髓检查确诊并进行FAB分型、免疫学分型，用统一方案治疗及随访，其中男性14例，女性6例；年龄2.5～13岁；根据患儿所处的疾病阶段将患儿分为3组：急性期组：7例，患儿系初发或复发未治或诱导治疗中尚未缓解；缓解组：7例，患儿经诱导治疗后缓解但持续缓解不足1年；长期缓解组：6例，患儿系治疗后持续缓解1年以上。全部骨髓均采自胸骨、髂前或髂后上嵴，肝素抗凝。对照组17例，为本院胸外科肺部疾患的病人，包括肺癌(11例)、支气管扩张症(3例)、肺不张(2例)、结核球(1例)。肺癌患者骨质未受侵犯，所有对照组病人外周血象正常，骨髓取自手术中切除的肋骨。

二、骨髓基质细胞的培养

病人及对照的BMSC的培养方法及鉴定参见文献^［1］。

三、正常骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cell, BMMC)的原代培养

用淋巴细胞分离液分离出正常BMMC，以2×10⁶／mL接种于培养皿中，培养体系及条件同BMSC，培养的细胞在7 d内备用，此时悬浮细胞主要是造血细胞。

四、Raji细胞

Raji细胞是淋巴瘤细胞，作为本实验中的肿瘤细胞，由本校肿瘤医院中心实验室孙韵老师惠赠。在含20%小牛血清的1640中培养，每2～3 d换液1次。

五、骨髓基质细胞粘附率的测定

参考文献^［2］，略加修改。将培养的骨髓基质细胞用0.25%胰蛋白酶+0.1% EDTA消化后，调整细胞浓度为1×10⁵／mL，接种于96孔培养板，每孔100 μL，37℃，5% CO₂孵育过夜。待基质细胞成层后，加入正常BMMC或Raji细胞，浓度依实验而定，每孔100 μL，继续孵育，孵育时间依实验而定。用PBS轻轻洗去未粘附的细胞，加入MTT(5 g/L)，每孔20 μL，再培养4 h。吸取培养上清，加入DMSO，每孔200 μL，使甲月替颗粒溶解。在酶标仪上测定OD值，波长570 nm，参考波长630 nm。骨髓基质细胞对照组只加入骨髓基质细胞，不加其他细胞，而以培养基代替，测OD值。在向骨髓基质细胞层上加入正常BMMC或Raji细胞的同时，取等量细胞同条件另行悬浮培养，加入MTT培养4 h后，离心去上清，再加入DMSO测定细胞的总OD值。计算公式：

粘附率(%)=(所测得OD值-骨髓基质细胞OD值)/(所加入细胞的总OD值)

每实验点重复3孔。

六、骨髓基质细胞表面粘附分子的测定

将培养的BMSC用0.25%胰蛋白酶+0.1% EDTA消化后，每份标本编3支试管，一管加入20 μL对照试剂(鼠IgG1-PE)和兔抗鼠IgG-FITC 5μL另两管分别加入CD106 2μL、CD54-PE2 μL，每管各加入细胞悬液100 μL(细胞5×10⁵)，室温(18～25℃)中孵育30 min，然后用PBS洗两次，CD106管再加入兔抗鼠IgG-FITC 5μL孵育30 min后PBS洗两次，最后各管加入300 μL PBS用流式细胞仪(美国Coulter公司生产)检测。将激光管预热30 min后用荧光微球调整仪器，使各放大器接收信号的HCV值＜2%，以对照管作为空白定标，计算10 000个细胞，记录标本的阳性细胞百分率。

七、ICAM-1和VCAM-1单克隆抗体对骨髓基质细胞粘附抑制率的测定

将培养的BMSC用0.25%胰蛋白酶+0.1% EDTA消化后，调整细胞浓度为1×10⁵／mL，接种于96孔培养板，每孔100 μL,37℃，5% CO₂孵育过夜。待基质细胞成层后，分别加入ICAM-1和VCAM-1单克隆抗体(购于美国Pharmingen公司)，10 μg/mL，继续培养1 h，然后用PBS洗去未与BMSC结合的抗体。实验分四组：对照组：不加粘附分子单克隆抗体；ICAM-1组：加入ICAM-1单克隆抗体；VCAM-1组：加入VCAM-1单克隆抗体；ICAM-1和VCAM-1组；同时加入ICAM-1和VCAM-1单克隆抗体。然后分别加入正常BMMC或Raji细胞，以下步骤与BMSC粘附率的测定相同。BMSC粘附抑制率的计算：

八、统计分析

应用t检验对实验数据进行统计学分析，数据用±s表示。

结果

一、ALL骨髓基质细胞的生长

对照组的BMSC于接种后1周左右开始形成集落，4周左右形成基质细胞层。而部分ALL患儿尤其是急性期组患儿BMSC生长缓慢，形成集落的时间可延长至1～2周，成层的时间也可延迟至4～5周，且形成的集落小，提示ALL患儿BMSC增殖能力差，也可能和ALL急性期骨髓单核细胞中白血病细胞比例增加而间质干细胞数量相对减少有关。

二、ALL骨髓基质细胞对骨髓造血细胞和肿瘤细胞粘附行为的变化

(一)达到最大粘附率的时间提前BMSC对BMMC和Raji细胞的粘附率和粘附的时间有关，随着粘附时间的延长，粘附率逐步增高达高峰。对照组BMSC对正常BMMC和肿瘤细胞粘附达高峰的时间为6 h，而急性期和长期缓解期的ALL患儿可提前至2 h，即使再延长粘附时间也不能增加粘附率。见图1和图2。

Fig 1 The relationship between the adhesion of BMSC to normal BMMC and adhesion time

1BMSC对正常BMMC的粘附与粘附时间的关系

Fig 2 The relationship between the adhesion of BMSC to Raji cells and adhesion time

2BMSC对Raji细胞的粘附与粘附时间的关系

(二)对正常骨髓造血细胞粘附的饱和浓度降低<