［摘要］目的：探讨肺炎衣原体在C57 BL/6J小鼠腹膜巨噬细胞泡沫化过程中的作用。方法：将肺炎衣原体与C57 BL/6J小鼠腹膜巨噬细胞培养72 h后用油红O方法染色观察细胞的形态变化并测定细胞内胆固醇的含量。结果：肺炎衣原体能使C57 BL/6J小鼠腹膜巨噬细胞胞浆内脂质颗粒增多，胆固醇酯占总胆固醇的比例增加。结论：肺炎衣原体能促进C57 BL/6J小鼠腹膜巨噬细胞泡沫化

［中图分类号］ R543［文献标识码］ A

［文章编号］1000-4718(2000)08-0730-04

The role of chlamydia pneumoniae in the course of transformation

of C57 BL/6J mouse peritoneal macrophages into foam cells

YANG Yong-zong

(Institute of Cardiovascular Disease of Hengyang Medical College，Hengang 421001，China)

JIN Jun-fei

(Department of Pathophysiology, Nanjing railway Medical College, Nanjing 210009, China)

［Abstract］AIM： In order to understand the role of chlamydia pneumoniae in the course of macrophages transformation into foam cells experiments with chlamydia pneumoniae standard strain AR-39 wese made. METHOD: C57 BL/6J Mouse peritoneal macrophages C57 BL/6J wese incubated 24 h, and they were divided into 6 groups to be incubated continually: A₁～DMEM; A₂～DMEM+10⁶ IFUs/L AR-39; B₁～DMEM+10mg/L LDL; B₂～DMEM+10mg/L LDL+10⁶ IFUs/L AR-39; C₁～DMEM+10mg/L OxLDL ;C₂～DMEM+10mg/L OxLDL+10⁶ IFUs/L AR-39. 72 h later, morphological changes of the cells were observed and of intracellular cholesterol of content was detected. RESULTS: 1、Morphological studies: there were no lipid particles in A₁，A₂ and B₁ groups, but the lipid particles could be found in B₂、C₁ and C₂ group, Among six groups, the most lipid particles were seen in C₂ groups. 2、Biochemical detection:The ratio of cholesterol ester to total cholesterol was much higher than 50% in B₂、C₁ and C₂ groups, but was less than 50% in A₁、A₂ and B₁ groups. CONCLUSION: Chlamydia pneumoniae may have played a role in promoting C57 BL/6J mouse peritoneal macrophages into foam cells.

［MeSH］Chlamydia pneumoniae; Macrophages; Foam cells; Atherosclerosis

自1988年Saikku等^［1］将肺炎衣原体（chlamydia pneumoniae，Cpn）与 动脉粥样硬化（atherosclerosis，As）联系起来后，大量的流行病学资料表明肺炎衣原体与动脉粥样硬化密切相关，实验动物、人尸检标本以及临床病人身上也存在二者密切相关的证据^［2］。但是Cpn在As发生与发展中的确切作用有待于更进 一步深入地研究。泡沫细胞的出现是As斑块中有特征性的病理形态改变，本实验在As易感小鼠C57 BL/6J腹膜巨噬细胞源性泡沫细胞模型上观察Cpn标准株 AR-39对C57 BL/6J小鼠腹膜巨噬细胞泡沫化的影响，以探讨Cpn在As过程中的可能作用。

材料与方法

一、材料

AR-39：由加拿大Monitoba大学钟光明博士赠送。实验动物：C57 BL/6J，100只，雄性，10周龄，体重(25±2.7)g，购自中国医学科学院实验动物繁育场。戊二醛、达氏修正依代培养基(Dulbeccos modified Eagles med, DMEM)培养基、Taq酶、dNTP、琼脂糖为Sigma公司产品，其它试剂均为国产分析纯。

二、实验分组

取C57 BL/6J小鼠腹膜巨噬细胞培养24 h让其贴壁后分为6组培养：A₁：DMEM；A₂：DMEM+10⁶ IFUs/L AR-39；B₁：DMEM+10mg/L低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL；B₂：DMEM+10 mg/LLDL+10⁶ IFUs/L AR-39；C₁：DMEM+10mg/L OxLDL(coxidized low density lipoprotein)；C₂: DMEM+10mg/L OxLDL+10⁶ IFUs/L AR-39。在35℃、5% CO₂条件下培养72h后进行形态学观察和细胞内胆固醇的定量分析。

三、AR-39的培养

选用12 cm²的培养瓶，内含DMEM（加有10% FCS，100 μg/mL链霉素，100μg/mL万古霉素），每一瓶中接种1mL的HeLa-229细胞悬浮液（内含2×10⁵个HeLa-229细胞），温育过夜形成融合的细胞单层。用DEAE-dextran处理^［3］后加入0.1mL（10⁸ IFUs/L）的AR-39储存液，轻轻摇动培养瓶，以便储存液能完全覆盖细胞单层，将培养瓶放入35 ℃培养箱中，每隔15 min摇晃1次，至少温育2 h让其完全粘附，轻轻加入5 mL DMEM（加有10%FCS、0.5μg/mL放线菌酮），培养72 h。用橡皮擦刮下感染的细胞，超声处理，让AR-39原体从细胞中释放出来（避免生热），离心（2800 r/min，10 min）取上清（含AR-39原体），再离心（9000 r/min，30 min）取沉淀（含AR-39原体），将原体悬浮在SPG（sucrose phosphate glutamate medium）^［3］中分装冻存或进一 步扩增。将部分原体重新感染HeLa-229细胞，培养72 h之后，经吉姆萨染色后 观察到衣原体包涵体，计数为10⁷ IFUs/L。

四、LDL的制备、氧化修饰及修饰程度鉴定^［4］

（一）LDL的制备人血浆LDL采用序列超速离心法制备。LDL在4℃、含0.1% EDTA的PBS中透析24 h，然后用0.22μm滤膜过滤除菌，保存于4 ℃冰箱中。LDL经琼脂糖凝胶电泳鉴定为同一区带。用Lowry法测得LDL的蛋白质含量为1.78 mg/mL(本文中所列脂蛋白浓度均以蛋白为准)。

（二）LDL的氧化修饰将新鲜的LDL置含10μmol/L Cu²⁺的PBS中，37℃透析12 h，然后在0.01% EDTA的PBS中透析24 h（4℃），除菌保存。

（三）氧化低密度脂蛋白(OxLDL)修饰程度鉴定修饰程度用脂蛋白所含LPO(lipid peroxide)含量来表示。用OxLDL中所含硫代巴比妥酸反应物质（thiobarbituric acid reactive substance，TBARS）的含量代表LPO的量。样品或丙二醛标准品0.1 mL加入到2.9 mL的混合液中（混合液含0.92 mol/L CCl₃COOH，0.026mol/L C₄H₄N₂O₂S，0.25mol/L HCl）100℃水浴30 min，冷却后测530 nm波长处的OD值得TBARS含量。 LDL中LPO含量为每克胆固醇3～5μmol/L TBARS被定义为轻度修饰，超过此值，被视为氧化，成为OxLDL。本实验用序列超速离心法从正常人血清中分离LDL，呈淡黄色，TBARS值为1.4 μmol/g胆固醇，Cu²⁺（10μmol/L)氧化修饰过程中，其颜色由黄色向乳白色转化，氧化修饰12 min后，可达16.5μmol TBARS/g胆固醇，根据定义已成为OxLDL。

五、巨噬细胞泡沫化

（一）巨噬细胞的收集和培养^［5］将10周龄的C57 BL/6J雄性小鼠处死后取腹腔巨噬细胞（调整细胞数为10⁹/L），接种到培养瓶中（内放盖玻片，便于形态学观察），每瓶2mL，在35℃、5% CO₂培养箱中培养24 h，弃培养液，PBS冲洗掉未贴壁细胞组分，重复3次，然后分为6组培养72 h。

（二）巨噬细胞泡沫化方法将上面所取巨噬细胞接种到培养瓶中，每瓶2 mL，在35℃、5%CO₂培养箱中培养24 h，弃培养液，PBS冲洗掉未贴壁细胞组分，重复3次。然后加入10mg/L OxLDL培养72 h，促成泡沫细胞。

1．形态观察将预先放入培养瓶内的盖玻片取出，用PBS液冲洗两次，用2.5%戊二醛固定3 h，双蒸水冲洗，2.5%重铬酸钾处理16 h，双蒸水洗净，放入油红O中染色20 min，双蒸水冲洗，在氧化苏木精中衬染20 min，双蒸水冲洗，用丙酮脱水后，香柏油封片，显微镜下观察可以看到细胞质中有红色的脂质颗粒，用Kodak 100彩色照相。

2．生化检测用0.25%胰酶消化培养细胞1 min，离心（1000 r/min、10 min）后弃去上清；用PBS液2mL洗涤2次，再离心（1000 r/min、10 min）弃上清；加0.1 mol/L NaOH 100μL，异丙醇100μL，超声5 min后再离心（1000 r/min、10min），取上清各50μL用试剂盒分别测总胆固醇（total cholesterol,TC）、游离胆固醇（free cholesterol,FC）及胆固醇酯（cholesterol ester,CE）。沉淀物用来测细胞内蛋白质，采用Lowry法。胆固醇酯占总胆固醇的50%以上可视泡沫细胞^［4］。

六、AR-39对巨噬细胞的感染及鉴定

将巨噬细胞培养24 h让其贴壁后，加入含30μg/mL DEAE-dextran的PBS溶液处理，后接种0.1 mL（10⁸ IFUs/L）的AR-39储存液，培养72 h（具体方法见前面AR-39的培养）。鉴定采用PCR方法，检测培养72 h之后的巨噬细胞中含AR-39 DNA。