［中图分类号］ R733.7 Q786［文献标识码］A

［文章编号］1000-4718(2000)08-0764-05

Advanced studies on antisense oligonucleotide treatment

and target-gene of leukemia

LI Wen-yu, ZHANG -Yuan

(Institute of Hematological Disease, Medical College of Jinan University,Guangzhou 510632, China)

［A Review］The oncogene expression and growth of leukemic cells could be inhibited by antisense oligonucleotide. The selection of target genes is the key step in the research of antisense oligonucleotide on leukemia. The article would review the status and prospect of some target genes of leukemia in the investigation of antisense oligonucleotide.

［MeSH］ Oligonucleotides,antisense; Leukemia; Genes,suppressor

反义技术是根据碱基互补原理，利用与目标靶DNA或RNA互补的短链片断封闭基因表达。反义技术用于抗白血病的理论基础，是用反义核酸中止原癌基因或癌基因的表达，使白血病细胞分化或凋亡，达到治疗的目的。其特点是，特异性强，对正常细胞无明显影响。反义核酸能在核酸水平上抗白血病，优于在蛋白水平的作用。基本内容包括：反义RNA、反义DNA、核酶（ribozyme）和三股螺旋DNA（DNA－Triplex）。主要通过下列作用之一或联合作用抑制靶基因表达：1.与双链DNA形成三链结构，使DNA转录受阻。2.结合靶mRNA，形成双链结构，激活核酶，降解靶mRNA或使靶mRNA翻译终止。3.使细胞表达核酶，降解特定基因片段。4.阻挡mRNA前体由核向胞浆转运或成熟，间接影响基因表达。急慢性白血病反义治疗的靶基因包括融合基因、点突变基因、正常基因、以及扩增基因。随着人类基因组计划的进行，新的基因会越来越多，基因靶点会越来越多，为反义技术带来广阔的前景。现就上述基因进行综述。

一、靶基因

1. 融合基因bcr/abl

慢性粒细胞白血病（chronic myelogonous leukemia, CML）细胞遗传学特征是胞内存在Ph染色体，大约95％CML患者Ph染色体阳性。Ph染色体是9号染色体上的c-abl原癌基因易位到22号染色体断裂点簇集区bcr，形成bcr/abl融合基因。根据bcr断裂点位置不同，此融合基因主要存在2种类型：bcr2/abl2（b2/a2，也称l-6型）和bcr3/abl2（b3/a2，也称k-28型），二者仅相差75 bp，都编码一种P210蛋白。它比c-abl编码的P145有更强的酪氨酸激酶活性，为CML发病基础，能在体外转化造血细胞，诱导CML。bcr/abl融合基因为CML特异的，DNA序列单拷贝，并且较稳定，理论上适合作反义治疗^［1］。

1991年，Szezylik等^［2］研究了反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide, ASON）对CML的影响。5例l-6型CML患者白血病细胞，被针对b2/a2（l-6型）ASON（5’-GAAGGGCTTCTTCCTTAT-3’）不同程度抑制，抑制率60%～90%；5例k-28型CML患者白血病细胞，被针对b3/a2（k-28）ASON（5’-GAAGGGCTTTTGAACTCT-3’）抑制，抑制率60%～80%，与l-6型结果相似。正常骨髓细胞与CML骨髓细胞1∶1比例混合，与断裂点特异的ASON一起培养12 d后，与未加入ASON的对照组相比，CML的骨髓细胞克隆数明显减少，而正常骨髓细胞克隆数无变化。说明ASON对正常细胞无抑制作用。若在k-28型CML中加入l-6型ASON，仅有2.5%～5％细胞生长被抑制，与未加入ASON组无明显差异，针对bcr/abl不同断裂点，ASON特异地抑制其细胞生长。

许多作者发现，ASON抑制CML细胞生长，是ASON引起CML凋亡的结果^［3］。凋亡机理部分作者认为与ASON下调bcl-2(b-cell lymphoma/leukemia-2)表达有关^［4］。

Skorski等^［5］，给SCID(severe combined immunodeficent)鼠输注CML急变细胞系BV173，造成与人CML相似的动物模型。白血病小鼠输注bcr/abl ASON，1 mg/d，连用9 d，发现白血病细胞克隆消失, bcr/abl mRNA明显降低。而未经ASON输注的小鼠，8～13周死于白血病。输注ASON小鼠，18～23周才死亡。

CML细胞经bcr/abl ASON处理后，生长受抑，而对正常细胞无影响。人们开始进行CML自体骨髓移植的体外净化工作。

Fabrittis等^［6］对加速期和第二次缓解期CML患者进行ASON(b2a2：5’-CGCTGAAGGGCTTCTTCCTTATT-GAT-3’；b3a2：5’-CGCTGAAGGGCTTTTGAACTGTGC-TT-3’)体外净化及自体骨髓移植。1例因CML急性变，自体骨髓移植后7个月死亡；3例移植后21～39个月急性变，1例移植30个月死于非移植相关疾病；3例移植维持缓解期达14～26个月。患者都曾出现过血液学完全缓解及生存期延长，鼓励人们继续这方面工作，将会发现更加特异有效的ASON，从而进一步提高患者生存率。

随着bcr/abl ASON作用于CML研究的深入，出现越来越多的矛盾现象。针对b2/a2的融合基因ASON经MTT法证实对含有b3/a2融合基因K562、Ba/F3的细胞株有明显抑制作用（可达50%），同样对含有b2/a2融合基因的BV173也有抑制作用。抑制P210蛋白表达，恢复P145蛋白表达。HL-60细胞株作为对照组，ASON对其无抑制作用^［7］，说明ASON抑制作用无顺序特异性。推测ASON与靶mRNA部分结合，激活RNA Hase, 其作用非顺序特异性，导致靶mRNA断裂。目前还没有合理解释。但却提示在设计ASON时，不仅应针对断裂点，还应尝试对bcr/abl mRNA的其它序列。

此外，CML为克隆性疾病，而bcr/abl在干细胞中无表达，因此有作者认为bcr/abl不是CML的真正靶基因^［8］。

相信对CML 发病机制的进一步探讨，人们将会尽快找到真正特异性序列的靶基因。

2. 点突变

p53基因定位于染色体17P13.1区，为一种抑癌基因。分为野生型、突变型。突变型在很多情况下是野生型发生点突变而致，它不具备抗细胞增殖作用，与肿瘤发生相关。故合成与突变型p53互补的ASON可能抑制白血病细胞的增殖。

在体外实验中，急性髓细胞白血病（acute myelogenous leukemia,AML）细胞株，针对p53第10个外显子的ASON，能明显降低白血病细胞的增殖；同时把加入ASON 的AML患者白血病细胞，与未加入ASON者对比，细胞减少90%^［9］，而对正常细胞无抑制作用。

Bishop等^［10］合成p53 ASON ［5’-d(CCCTGCTCCCCCCTGGCTCC)-3’］进行体内实验。6例难治性AML、10例进展中骨髓增生异常综合症，给予p53 ASON，0.05～0.25 mg*kg^-1*h^-1,连用10 d，发现对患者骨髓白血病细胞有明显抑制作用，但未能使白血病细胞消失，无1例完全缓解。其中1例骨髓增生异常综合症患者，进展为AML。经蒽环类化疗药物加阿糖胞苷标准化疗方案化疗，达完全缓解。再经大剂量阿糖胞苷巩固治疗，完全缓解期达1年。化疗效果明显提高。

在最适浓度、条件下，此种ASON仅能使白血病细胞减少1/10 ～1/100^［19］。其抑制白血病细胞增殖主要依赖于急性DNA损伤。因此，推测与蒽环类、足叶乙甙等导致DNA损伤的化疗药物联合应用，也许有协同作用，提高杀伤效果。在体外实验中证实，此种ASON与蒽环类化疗药有相互协同作用^［11］。这为p53反义治疗带来一些希望。

3. 正常基因

有些正常基因对维持白血病细胞的表型、生长、增殖有重要作用，而对正常造血干细胞生长、分化的作用，不如前者。因此也作为反义治疗靶基因，如CML中的原癌基因c-myb, 它是被最早进行反义治疗研究的原癌基因之一。

c-myb定位于6号染色体，编码一个75 kD核结合蛋白myb，是细胞周期G/S中重要转换基因。

c-myb参与正常造血调控，具有调控多种造血祖细胞功能，尤其对晚期造血祖细胞更重要^［12］。但普遍存在于白血病细胞系，并且ASON抑制myb表达，抑制白血病细胞增殖^［13］，说明c-myb 表达对白血病细胞同样必要。并发现白血病细胞系生长比正常细胞对c-myb更敏感^［14］。

Ratajczak等^［15］合成的myb ASON，与11例CML患者的骨髓或外周血白血病细胞共同孵育24 h。有4例处于急变期，ASON均能明显抑制CML克隆形成；有7例处于慢性期，其中4例CML克隆明显被抑制。白血病克隆遭到抑制的8例患者，经RT-PCR发现其中6例的bcr-abl mRNA完全消失。慢性期患者bcr-abl mRNA完全消失意味着治愈的可能性，并提示人们是否可将c-myb 用于CML体外净化工作。同时说明c-myb 能够调节bcr-abl基因表达。c-myb、bcr-abl ASON联合应用可能会提高CML反义治疗水平。

c-mybASON抑制白血病细胞增殖可能与G/S期阻滞有关。此外，有些作者发现c-myb调控c-kit基因表达，为其上游基因。c-kit编码造血细胞上的酪氨酸激酶受体，酪氨酸激酶与细胞生长、增殖有关^［27］。c-kit功能受抑时，造血细胞发生凋亡^［16］。故c-mybASON封闭myb表达，c-kit下调，造血细胞发生死亡。

4. 扩增基因：

反义治疗的靶基因还包括扩增而过度表达的基因，如bcl-2及多药耐药基因（multidrug re