［摘要］目的：研究海马神经元缺血再灌注后线粒体相关基因的表达。方法：改良Pulsinell四血管阻断模型致大鼠脑缺血10min再灌注24 h后，取新鲜海马组织抽提mRNA。逆转录后经液相杂交递减无差异表达序列。以抑制性PCR方式扩增差异表达序列。之后构建cDNA文库，测序鉴定阳性克隆。最后应用斑点杂交确认差异表达。结果：构建cDNA文库后获得的78个阳性克隆中有7个克隆经最后的鉴定具有差异表达性。测序提示为细胞色素氧化酶C亚单位和NADH-泛醌氧化酶复合体4链的表达性片段。结论：细胞色素氧化酶C亚单位的差异表达从另一个侧面证实了之前提出的再灌注损伤中细胞色素氧化酶C的重要作用。再灌注损伤后NADH-泛醌氧化酶复合体4链的表达提示原来功能不明的NADH-泛醌氧化酶复合体β亚基可能在这一病理过程中发挥一定的作用。

［中图分类号］R743.31［文献标识码］A

［文章编号］1000-4718(2000)08-0722-04

Mitochondria respiratory chain related genes expression

in post ischemia/reperfusion rat

WU Qi， DENG Xiao-ming， XIONG Yuan-chang， LIU Shu-xiao

(Department of Anesthesiology, The Second Military Medical University Affiliated Changhai Hospital, Shanghai 200433，China)

YUAN You-zhong

(Department of Hematology, The Second Military Medical University Affiliated Changhai Hospital, Shanghai 200433，China)

［Abstrac］AIM: Apply the newly invented method of suppression subtractive hybridization to scan the mitochondria genes expression of hippocampus neurons in post ischemia/reperfusion rats. METHODS: Decapitate the rats suffering 10 min of whole brain ischemia and 24 h of reperfusion in Pulsinelli’s 4 vessels occlusion ischemia/reperfusion model. Dissociated hippocampus and isolated mRNA. After reversed transcription, use SSH to subtract the common sequences, then use suppressed PCR to amplify the differentially expressed sequences. After cloning and DNA sequencing, the dot hybridization was used to finally identify the differential gene expression. RESULTS: In the 78 positive clones acquired from cloning, 7 clones represent differential gene expression after confirmed by clone PCR, dot blot and DNA sequencing. The DNA sequencing data indicate these clones are ESTs of Cytochrome c oxidase subunit and NADH-ubiquinone oxidoreductase chain 4 gene. CONCLUSION: Cytochrome C oxidase mRNA level changs during brain ischemia /reperfusion. The differential expression of NADH-ubiquinone oxidoreductase chain 4, one of those 13 subunits of subcomplex β, suggests that subcomplex β may have important function associated with pathophysiologic changs in reperfusion injury.

［MeSH］Ischemia；Reperfusion injuries；Gene expression；DNA，mitochondrial；Rats

脑缺血/再灌注损伤后常会观察到原有的一些神经功能损害程度并不是静止在缺血的当时，而是进行性加重。这是因为调节这些功能的神经元发生延迟性死亡了。这种病理变化通常是凋亡。发生凋亡的神经元在受到致死性刺激的最初48 h内还能保持结构的完整。这提示：凋亡是一个过程，如果在这时间之内能有一些有效措施阻止凋亡的级联效应，那么挽救凋亡神经元是可能的。凋亡还是一种耗能的程序性死亡。线粒体不仅因为它是能量转换器而涉及到凋亡的调控中，更有证据表明线粒体的某些组份直接参与了凋亡的调控过程^［1］。Diatchenko等^［2］报道的抑制递减杂交法（suppression subtractive hybridization, SSH）能有效检测两个不同细胞群差异表达基因的方法。本研究应用该方法检测缺血再灌注后线粒体基因的表达。

材料和方法

一、脑缺血模型复制与分组

选用雄性SD大鼠,体重250～300 g。脑缺血模型采用改良的Pulsinelli法复制，即异戊巴比妥麻醉下烧闭双侧椎动脉同时双侧颈总动脉套线。24 h后，动物清醒下，拉紧双侧缝线并保持一定张力，阻断双侧颈总动脉造成脑缺血10 min。剪断缝线并抽出，开放颈总动脉血流造成再灌注24 h。正常对照组与脑缺血组动物各6只，断头处死大鼠，打开颅腔，取出海马组织后迅速放入液氮中速冻。24 h后转移至-85℃低温冰箱中保存。

二、海马组织mRNA的抽提、鉴定和浓缩

液氮冷冻条件下将海马组织捣碎成粉末。应用组织/细胞总RNA抽提试剂盒（Watson公司）抽提总RNA。随后应用mRNA Isolation Kit for Blood/Bone Marrow（Boehringer-mannheim，Germany）抽提mRNA，即polyA（+）RNA。

三、抑制性递减杂交分析

未经特别说明，试剂主要由PCR-Select^TM cDNA Subtraction kit(Clontech, USA)提供。

cDNA合成引物：5′-TTTTGTACAAGCTT₃₀N₁N-3′。

连接器1序列： 5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3′

3′-GGCCCGTCCA-5′

连接器2序列： 5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3′

3′-GCCGGCTCCA-5′

PCR引物1： 5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCTC-3′

巢式PCR引物1： 5′-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3′

巢式PCR引物2： 5′-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT -3′

(一)mRNA逆转录合成cDNA模板采用经分光光度计精确定量的mRNA (0.5 μg/μL)。

(二)限制性酶切反应及连接器的连接反应cDNA产物纯化后经RsaⅠ限制性酶切后,实验组酶切产物分成相同的两组，分别接上连接器1和连接器2。

(三)液相杂交第一轮杂交是由两组独立的杂交反应组成的, 杂交体系的构成为RsaⅠ限制性酶切后的对照组cDNA，带连接器的实验组cDNA(两组杂交反应分别含不同的连接器)，1×杂交缓冲液。第一轮杂交的反应参数（98℃变性1.5 min, 68 ℃保温8 h）。第一轮杂交后进入第二轮杂交反应。在同一杂交体系中混合上述两组独立的杂交反应。同时在杂交体系中加入新鲜变性的RsaⅠ限制性酶切后的对照组cDNA，造成杂交体系中该成分过量。第二轮杂交的反应参数（68℃杂交过夜）。

(四)抑制PCR第一轮PCR体系中,模板为第二轮杂交产物,PCR引物为PCR引物1。第二轮PCR体系中，模板为第一轮PCR产物，PCR引物为巢式PCR引物1和巢式PCR引物2。

四、cDNA文库的构建和测序分析

利用T/A cloning kit（Promega，USA），将第二轮PCR扩增产物插入T-Vector中。根据α 互补的原理,在涂布X-gal的琼脂平板上筛选出带插入片断的菌落。进一步以菌落PCR鉴定。抽提质粒进行全自动DNA测序。质粒的抽提采用Plasmid Mini Kit（Qiagen，USA）。 通过e-mail与genbank联系，借助BLAST程序分析核酸及蛋白的同源性。

五、斑点杂交

将送测序的质粒中的插入片断制备成［α-³²P］dATP标记的探针，［α-³²P］dATP购自北京亚辉生物医学工程公司，探针标记的试剂来自Megaprime^TM DNA labelling systems（Life science，USA）。将大约1μg正常组和实验组总RNA直接烤膜固定到尼龙膜上(Hybrond, Germany)。杂交过程和洗膜过程参照《分子克隆实验指南》^［3］。杂交膜在cyclone磷屏成像系统中曝光、扫描成像后储存于计算机中。

结果

初步构建了大鼠脑缺血再灌注后差异表达的cDNA 文库。根据α互补的原理筛选出78个阳性克隆。同时由于差异表达cDNA 在构建文库前已被RsaⅠ限制性酶切，片断大小约为0.1～2 kb。 因而在菌落PCR中可借助来进一步鉴别阳性克隆。进一步筛选后得到12个阳性克隆（图1）。阳性克隆抽提质粒后行全自动测序分析。其中1、2、5、10、11、12号克隆对应细胞色素氧化酶C亚单位；3号克隆为ATP合成酶e链；4号克隆为NADH-泛醌氧化酶复合体4链（ND₄）；6号克隆为40S核糖体蛋白；7号克隆为硫糖蛋白-2；8号克隆为tRNA; 9号克隆为ATP合成酶a链。选择4、5、7、9号克隆，按材料方法中所述步骤进一步以斑点杂交验证差异表达性，结果4、5号克隆显示了差异表达（图2）。

NADH-泛醌氧化酶复合体4链的表达片段资料为：

3'TCACAGGAATATACTCAATATATATGATTATCACAAC

CCAACGAGGAAAACTAACCAGCCACATAAACAACCT

CCAACCTTCCCACACACGAGAATTAACACTCATAGCT

CTACACATTATTCCCCTCATACTATTAACAATCAACCC

TAAACTCATCACAGGCCTAACAATA 5'