［摘要］目的：探讨高血压血管平滑肌细胞（VSMC）在胰岛素作用下胞内信号转导途径之一丝裂原活化蛋白激酶(MAPK）的影响，及其与VSMC增殖的关系。方法：选用6周龄自发性高血压大鼠（SHR）和WKY大鼠，无菌分离主动脉，体外纯化培养VSMC至6～8代，加胰岛素干预和蛋白激酶C(PKC)抑制剂，采用胶内髓磷脂碱性蛋白原位磷酸化法测定VSMC中MAPK活性，并用Western Blot检测VSMC中MAPK的含量，［³H］-TdR测定VSMC的DNA合成量。结果：胰岛素作用后，SHR组的DNA合成量显著增加，MAPK活性及蛋白含量也显著增加，PKC抑制剂可明显降低MAPK活性。结论：SHR体外培养的VSMC增殖与MAPK活性增加有关，胰岛素可影响其活性，并且可能存在胰岛素-PKC-MAPK轴。

［中图分类号］Q253［文献标识码］A

［文章编号］1000-4718(2000)07-0596-04

Effects of insulin on mitogen-activited protein kinase of

vascular smooth muscle cells in spontaneously hypertensive rat

WANG Xu-kai,LIU Guang-yao, YANG Cheng-ming, LI Min

(Department of Cardiology, Daping Hospital, The 3rd Military Medical University, Chongqing 400042, China)

WANG Yan

(Department of Molecular Biology, The 3rd Military Medical University, Chongqing 400038, China)

HE Zuo-yun

(Department of Cardiology, Xingqiao Hospital, The 3rd Military Medical University, Chongqing 400037, China)

［Abstract］AIM:To explose the possible existing pathway of intracellular signaling transduction in hypertensive induced by insulin in rat vascular smooth muscle cells proliferation which involved mitogen-activated protein kinase. METHODS:Male spontaneously hypertensive rat (SHR) aorta and WKY(6 weeks old) were isolated and then cultured to make the purified vascular smooth muscle cells.6-8th generation of VSMC were interfered with insulin in vitro. MAPK activity was determined by myelin basic protein method and its volume was measured with Western Blot. And ［³ H］-TdR was used to measure DNA synthesis in VSMC proliferation. RESULTS: After the interfered with insulin the DNA synthesis was increased obviously in SHR group. MAPK activity and its contains in SHR were increased more than the control group. Protein kinase C inhibitor decreased MAPK activity induced by insulin. CONCLUSION:Proliferation of SHR VSMC in vitro was correlated with increased activity of MAPK. Insulin can affect MAPK induced activity. So an insulin-PKC-MAPK axis may exist in hypertensive VSMC.

［MeSH］Insulin; Hypertension; Muscle, smooth, vascular; Protein kinases

高血压的发病机制十分复杂，其主要病理改变是血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMC）增生、肥大，造成血管壁肥厚，管腔狭窄。胰岛素在VSMC增殖中的作用日益引起人们的关注。在先前的研究中已证实胰岛素对VSMC增殖及DNA合成有促进作用^［1］。引起VSMC增殖是通过激活PKC途径^［2］。丝裂原活化蛋白激酶家族是与细胞增殖调控关系最为密切的细胞内信号转导蛋白激酶，是细胞外信号与细胞核之间信息传递的共同通路^［3］。本工作在体外培养的自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat,SHR)和WKY大鼠主动脉VSMC上观察胰岛素对丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)的影响，以及对VSMC增殖在SHR和WKY的不同特点，以寻找可能存在的信号转导途径。

材料和方法

一、材料

SHR 和WKY大鼠由北京阜外医院动物所提供；佛波脂（phorbol12-myristate13-acetate， PMA）、髓磷脂基质蛋白（myelin basic protein， MBP）、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)-inhibitor (bisindolymaleimide)、抗MAPK多克隆抗体购自Sigma公司; leupeptin、insulin、PMSF购自Boehringer Mannhem公司; 胎牛血清和DMEM购自GIBCO公司; 羊抗兔抗体购自中山公司；［γ-³²P］-ATP购自北京亚辉原子能研究所；［³H］-TdR购自中国医学科学院原子能研究所。

二、SHR和WKY大鼠的VSMC培养

选用6周龄的大鼠，按参考文献^［4］方法分离和传代培养VSMC，细胞鉴定后于第4周开始转种传代，细胞于第6～8代用于本实验。

三、［³H］-TdR掺入法测VSMC DNA合成量

制备2×10⁵ cells/mL悬液接种于24孔培养板，孵育24 h，贴壁后换无血清DMEM培养液24 h，然后每孔分别加入（对照组不加）PKC抑制剂2 μg/mL，孵育24 h后再加入insulin 10^-7 mol/L和PMA 1 nmol/L, 孵育16 h后每孔内加入［³H］-Thymidine 3.7×10⁴Bq/mL, 孵育8h,加入冷PBS液终止反应，在Milliper上经微孔滤膜收集细胞，并用10%三氯醋酸处理，滤膜烘干后置闪烁瓶中，加入闪烁液在液闪计数仪上测定［³H］的放射性。

四、MAPK免疫印迹及活性测定

按Arnods等^［5］的方法改进。接种1×10⁶ cells/mL于24孔培养板，孵育24 h后移至无血清培养液培养24 h。分别加和不加PKC抑制剂2 μg/mL，孵育24 h后再加入insulin 10^-7 mol/L和PMA 1 nmol/L, 孵育10 min，用冷PBS液洗涤细胞后换MAPK提取缓冲液在冰上孵育30 min，14000 r/min 4℃ 30 min取上清，用10%SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度；另调蛋白浓度至200 μg/mL 以备测量MAPK活性。MAPK免疫印迹：取20 μg/mL蛋白样品行10%SDS-PAGE电泳，按参考文献^［5］方法进行电转运于硝酸纤维膜，抗MAPK抗体浓度为1∶5000，4℃过夜，PBST洗5 min×3次，按SP试剂盒说明书进行酶显色反应。MAPK活性测定：采用胶内髓磷脂碱性蛋白（myelin basic protein， MBP）原位磷酸化法^［5］测定VSMC中MAPK活性，取20 μg/mL蛋白样品，行10%SDS-PAGE电泳，凝胶经充分洗脱、酶变性和复性处理，复性后的凝胶与［γ-³²P］-ATP 18.5×10⁴Bq/mL共同孵育，再用含1%焦磷酸钠的5%（W/V）三氯乙酸溶液洗脱凝胶，然后行干胶放射自显影。将相对应的凝胶切下，置于液闪液中进行计数，测定［³²P］掺入的放射活性。MAPK活性用pmol［³²P］/min蛋白表示，各组均为复管测定，同一实验重复5次。

五、统计方法

结果以均数±标准差（±s）表示，Microsoft Excel统计程序进行差异显著性分析。

结果

一、胰岛素对SHR的VSMC增殖的影响

胰岛素刺激组的SHR和WKY大鼠［³H］-TdR掺入量明显高于空白对照（空白组增加34%，SHR组增加了126%，WKY组增加了105%），SHR的VSMC对胰岛素刺激后的DNA合成较WKY显著增多，而加入PKC抑制剂作用24 h后,再用胰岛素和PMA作用，其细胞生成增加与空白对照组比较差异不显著，图1。

二、胰岛素对VSMC内MAPK含量及活性的影响

胰岛素可促SHR及WKY大鼠的VSMC内MAPK含量增加，如图2A所示；发现在胰岛素作用后SHR和WKY两种大鼠的MAPK活性均增高，差异显著（P＜0.05）。胰岛素对两种大鼠的VSMC内MAPK活性均有激活效应，SHR组中胰岛素vs空白为492.8 vs 121.1; WKY 组中胰岛素vs空白组是389.6 vs 105.7 pmol［³²P］/min pro P＜0.01。然而若给予PKC抑制剂处理24 h，可使胰岛素对MAPK的促活作用明显受到抑制，SHR组：胰岛素+PKC抑制剂vs胰岛素是118.2 vs 492.8 ; WKY组：胰岛素+PKC抑制剂vs胰岛素是 115.3 vs 389.6 pmol［³²P］/min pro P＜0.01，如图2B所示。

Fig 1The effects of various agents on ［³H］-TdR incorporation of VSMC

(Control=blank group;PMA=VSMC preincubated with PMA;Insulin=VSMC preincubated with insulin;PKC inhibitor+PMA=VSMC preincubated with inhibitor and PMA; PKC inhibitor+insulin=VSMC preincubated with control and PKC inhibitor)

**P＜0.01，vs control and PKC inhibitor；

*P＜0.05，SHR vs WKY (±s, n=5)

1不同因素对VSMC［³H］-TdR掺入实验的影响

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