［摘要］目的：观察钙调神经磷酸酶(CaN)在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激的大鼠心肌细胞肥大中的作用及其活性调节。方法：建立AngⅡ诱导的大鼠心肌细胞肥大模型，观察CaN抑制剂对AngⅡ刺激的心肌细胞［³H］-亮氨酸掺入的影响，以及各种因素对心肌细胞CaN酶活性的影响。结果：10、 100、 1000 nmol·L^-1的AngⅡ作用12 h分别使心肌细胞的CaN活性增加了13%、 57%（P＜0.05）、 228%(P＜0.01)。AngⅡ（10 nmol·L^-1）刺激心肌细胞2 h内，CaN活性与对照组无明显差异（P＜0.05）;AngⅡ刺激心肌细胞12 h以上，CaN活性才明显增高（P＜0.05）。Losartan（50 μmol·L^-1）、H₇（50 μmol·L^-1）及Fura-2/AM（4 μmol·L^-1）可明显抑制AngⅡ刺激的心肌细胞CaN活性;而PD98059（50 μmol·L^-1）对AngⅡ刺激的心肌细胞CaN活性无明显影响。AngⅡ(10^-7mol/L)刺激的大鼠心肌细胞［³H］-亮氨酸掺入明显高于对照组(P＜0.01)，而CaN特异性抑制剂-环孢素A(0.5～5 μg/mL)可以明显抑制AngⅡ刺激的心肌细胞［³H］-亮氨酸掺入。结论：依赖Ca²⁺/CaM活化的CaN可能在AngⅡ刺激的心肌细胞肥大中起重要作用；CaN的活化可能有赖于胞内Ca²⁺水平的持续升高，另外，CaN的活性还可能受到蛋白激酶C等信号分子的磷酸化调节。

［中图分类号］R542.2［文献标识码］A

［文章编号］1000-4718(2000)07-0588-04

Role and regulation of calcineurin in angiotensin

Ⅱ-stimulated cardiac myocyte hypertrophy of rats

FU Min-gui, CHEN Ya-hong, LI Shu-lian, XU Song,

PANG Yong-zheng, LIU Nai-kui, TANG Chao-shu

(Institute of Cardiovascular Diseases, the First Hospital, Beijing University， Beijing 100034， China)

［Abstract］ AIM: To study the role and regulation of calcineurin(CaN) in angiotensin II(AngⅡ)-stimulated cardiacmyocyte hypertrophy of rats. METHODS: Using AngⅡ to induce the cultured cardiac myocyte hypertrophy of rats, and investigating the effect of CaN inhibitor on ［³H］-leucine incorporation of AngⅡ-stimulated cardiomyocytes and the regulation of various factors on CaN activity in cardiomyocytes.RESULTS: AngⅡ can stimulate the CaN activity in cultured neonatal rat cardiomyocytes in a dose- and time-dependent manner. In cardiac myocytes incubated with 10, 100, 1000 nmol·L^-1 of AngⅡ for 12h, the CaN activities increased respectively by 13%,57%(P＜0.05) and 228%(P＜0.01) compared with that in non-stimulated cardiomyocytes. The CaN activities in AngⅡ-stimulated cardiomyocytes were significantly inhibited by losartan（50 μmol·L^-1）, H₇（50 μmol·L^-1）and Fura-2/AM（4 μmol·L^-1）,while no effect was observed with PD98059（50 μmol·L^-1）.The ［³H］-leucine incorporation in AngⅡ-stimulated cardiomyocytes increased by 46%(P＜0.01) compared with that in control group, which was dramatically inhibited by cyclosporin A(0.5～5μg/mL). CONCLUSIONS: Calcineurin, a Ca²⁺/calmodulin-dependent protein phosphatase, may play an important role in AngⅡ-induced cardiac myocyte hypertrophy. The activation of CaN may dependent on the sustained increases of ［Ca²⁺］i and be regulated by some protein kinases (such as PKC,etc.).

［MeSH］Myocardium； Cell; Rats; Phosphatases

钙调神经磷酸酶（calcineurin，CaN）是迄今发现的唯一受Ca²⁺/钙调素（calmodulin,CaM）调节的蛋白磷酸酶，广泛分布于脑、心肌、骨骼肌、T淋巴细胞等组织细胞中，参与多种细胞功能的调节^［1］。新近的研究发现^［2］，CaN在心肌肥大的发生发展中起重要作用，它可能是胞内Ca²⁺信号致肥大反应的转力点。血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）具有心肌细胞生长因子样作用，是致心肌肥大的重要体液因素之一，胞内Ca²⁺浓度升高是AngⅡ致心肌细胞肥大的中心环节。本研究在培养的新生大鼠心肌细胞上，观察AngⅡ对培养心肌细胞CaN活性的影响，以及抑制CaN活性对AngⅡ刺激的心肌细胞［³H］-亮氨酸掺入的影响，以探讨CaN在AngⅡ刺激的大鼠心肌细胞肥大中的作用及其活性调节机制。

材料和方法

一、 动物与主要试剂

1 d龄Wistar乳鼠由本校实验动物中心提供。RPMI 1640干培养基购自Gibco公司，环孢素A(cyclosporin A,CsA)购自Sandoz公司，AngⅡ、CaN、H₇、PD98059、CaM、PNPP、Fura-2/AM均为Sigma公司产品，［³H］-亮氨酸(3.7 kBq/mL) 为中国原子能研究所产品，其余试剂均为分析纯级。

二、 细胞培养

按Simpson等^［3］ 描述的方法培养大鼠原代心肌细胞。用0.125%胰酶分部消化分离大鼠心室肌细胞，在含10%胎牛血清的RPMI 1640中，于37℃、5% CO₂-95%空气的条件下培养。在培养的第2 d,加入5'-嗅脱氧尿苷（0.1 mmol·L^-1）,以抑制非心肌细胞的生长。培养5～6 d, 心肌细胞生长状态良好,开始实验。

三、 钙调神经磷酸酶活性测定^［4］

以2×10⁵ cells/mL密度的心肌细胞接种于24孔板，培养24 h后改用低浓度血清（2%）培养液培养，12 h后更换含不同药物的培养液(观察药物对AngⅡ作用的影响时，各试剂均预先加入，30 min后再加入10^-7mo1/L的AngⅡ，Fura-2/AM加入培养液30 min后，用无血清培养液洗涤1次，再加含AngⅡ的培养液)。继续培养12～24 h后，收集细胞于Eppendorf管中，加50 μL细胞匀浆液(含50 mmol/L Tris,pH 7.5，0.5 mmol/L DTT，50 μg/mL PMSF，50 μg/mL STI，5 μg/mL leupeptin, 5 μg/mL aprotinin)，超声破碎细胞，取上清，应用考马斯亮兰法蛋白定量后进行CaN活性测定。测定方法：底物I液含50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，0.5 mmol/L DDT，0.2 mg/mL BSA，10 mmol/L PNPP，2 mmol/L CaCl₂，0.3 μmol/L CaM。底物Ⅱ液含3 mmol/L EGTA，不含CaCl₂和CaM。测定时取待测提取液20 μL与底物液380 μL 30℃保温30 min，立即在酶标仪上410 nm读取吸光度，以空白底物液调零,每样本用底物I液测出的值为磷酸酶的总活力；底物II液测出的值是非CaN的其它磷酸酶活力，二者之差即CaN酶活力，结果以比活力(ΔA_410nm/mg Pr)表示。

四、 ［³H］-亮氨酸掺入

实验分4组，AngⅡ组每孔加 AngⅡ 10^-7 mol/L；CsA_0.5组和CsA₅组除AngⅡ外，分别另加CsA0.5和5 μg/mL；对照组不加处理因素。24h后加入［³H］-亮氨酸3.7 kBq/孔，继续培养24 h ，将细胞收集于玻璃纤维滤膜上，用 10%高氯酸破碎细胞，PBS冲洗，滤膜烘干后置于5 mL闪烁液的测定瓶内，用LKB液体闪烁仪测定［³H］放射性强度。

五、 细胞活力测定

应用0.5 μg/mL和5μg/mL的 CsA与心肌细胞共孵育24 h，取培养上清作乳酸脱氢酶(LDH)测定；细胞用0.2%台盼兰染色，在显微镜下计算每100个细胞中着色细胞数。

六、 统计分析

所有数据均以均数±标准差(±s)表示,采用多组间方差分析及q检验作统计学处理。

结果

一、 AngⅡ对大鼠心肌细胞CaN活性的影响

10～1 000 nmol·L^-1的AngⅡ可以浓度依赖的方式增加心肌细胞的CaN活性;与对照组相比,10、100、1000 nmol·L^-1的AngⅡ分别使心肌细胞的CaN活性增加了13%、57%（P＜0.05）、228%(P＜0.01)，见图1所示。AngⅡ(10 nmol·L^-1)刺激心肌细胞2 h内，CaN活性与对照组无明显差异(P＜0.05);刺激心肌细胞12 h，CaN活性轻度高于对照组 (5.10±0.82 vs 4.51±0.43 A₄₁₀/mg Pr.)；24 h心肌细胞CaN活性明显高于对照组(6.26±1.32 vs 4.51±0.43 A₄₁₀/mg Pr.，P＜0.05)。

Fig 1 The curve of dose-effect of AngⅡ on CaN activity in cultured rat cardiac myocytes (±s, n=6)

·P＜0.05, ··P＜0.01, vs control

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