［摘要］目的：建立CROC-1基因表达被阻断的FL-CROC-1^-细胞系，研究CROC-1基因在细胞生长中的作用。方法： 运用反义技术将新近发现的人泛素缀合酶样蛋白基因CROC-1的适当长度cDNA片断克隆到本室改建的真核细胞表达载体pMAMneo-amp^-中，经限制性内切酶图谱分析筛选出反向插入的表达CROC-1反义RNA的重组质粒。将此反义表达重组质粒(pMAM-antiCROC-1)用改良的磷酸钙法转染人羊膜FL细胞并用含G418的培养基筛选，测定G418抗性的FL-CROC-1^- 细胞系的生长速度。结果：建立的FL-CROC-1^- 细胞系在地塞米松诱导下CROC-1基因表达被反义抑制后，其生长速度较对照FL细胞及转染了载体pMAMneo-amp^- 的FL细胞(FL-MAMneo)的明显要慢(P＜0.05)。结论：本研究成功地建立了CROC-1基因表达被阻断的FL-CROC-1^- 细胞系，并提示CROC-1基因编码的泛素缀合酶样蛋白在细胞生长中起正调控作用。

［中图分类号］Q344^＋.13［文献标识码］A

［文章编号］1000-4718(2000)07-0577-04

The antisense block of CROC-1 gene expression

makes cells grow slower

CHEN Jian-ming, YU Ying-nian, CHEN Xing-ruo

(Department of Pathophysiology, Medical School of Zhejiang University, Hangzhou 310031， China)

［Abstract］ AIM：To establish FL-CROC-1^- cell line in which CROC-1 gene expression was blocked and study the role of CROC-1 gene in cell growth. METHODS：The appropriate length cDNA fragment of the recently identified human gene CROC-1 which encodes ubiquitin-conjugating enzyme like protein(Ubc-like protein) was cloned into the reconstructed eukaryotic expression vector pMAMneo-amp^- by antisense strategy. The recombinant plasmid which can express CROC-1 antisense RNA was selected by restriction enzyme map analysis. The antisense expression recombinant plasmid pMAM-antiCROC-1 was then transfected into human amnion FL cells by a modified calcium phosphate-mediated transfection procedure and selected with MEM medium containing 400 μg/mL geneticin. Finally ,the growth rate of the G418 resistant FL-CROC-1^- cell line was determined. RESULTS：When the antisense inhibition of CROC-1 gene expression was induced by dexamethasone, the growth rate of the FL-CROC-1^- cell line was obviously slower as compared with that of the control FL cell and FL-MAMneo cell which was established by transfection of plasmid pMAMneo-amp^- (P＜0.05). CONCLUSIONS：FL-CROC-1^- cell line was successfully established in this study and the result of FL-CROC-1^- cell growth suppression suggests that CROC-1 gene encoded Ubc-like protein plays a positive regulation role in cell growth.

［MeSH］ RNA, antisense； Ubiquitin;Gene expression regulation

泛素(ubiquitin)存在于所有真核细胞中，是一种高度保守的76个氨基酸残基的蛋白。细胞蛋白的泛素化修饰起靶向信号(targeting signals)的作用，可使底物蛋白发生26S蛋白酶体介导的泛素依赖性蛋白水解，蛋白的这种及时的选择性降解在细胞的许多代谢过程中起关键作用^［1］。泛素需经过E1-E2-E3酶促级联反应才能缀合到底物蛋白，在缀合途径中，泛素缀合酶(ubiquitin-conjugating enzyme,Ubc, E2)起关键作用^［1］。真核细胞内最近还发现了一类泛素缀合酶样蛋白(Ubc-like protein)，又名Uev(ubiquitin-conjugating E2 enzyme variant)蛋白，它们在序列及二、三级结构上类似于泛素缀合酶，但缺乏泛素缀合酶催化活性所必需的关键性半胱氨酸残基，因此，泛素缀合酶样蛋白不具备泛素缀合活性^［2］。人体细胞内目前已发现有3种Uev，即Uev-1/Croc-1、Uev-2/hMms2及Tsg101，酵母细胞中只发现1种，即Mms2。泛素缀合酶样蛋白可能是蛋白泛素化的新的调节因子，在体内以E2酶显性负变异体的形式起作用^［2］。遗传分析发现酵母Mms2蛋白参与其细胞内的无误性复制后修复(error-free postreplication repair，error-free PRR)通路。泛素缀合酶样蛋白可能起增加泛素缀合的底物蛋白多样性及选择性作用^［3］。本文运用反义技术建立CROC-1基因表达被阻断的FL-CROC-1^- 细胞系并对其生长速度进行测定。

材料和方法

一、CROC-1反义RNA表达重组质粒的构建

重组有Croc-1B全长cDNA序列的重组质粒pBluescript-C1B-pBS-C1B)由加拿大Saskatchewan大学的W. Xiao博士赠送。经ACC Ⅰ(TaKaRa)酶切，切出的840 bp长片断包含Croc-1B蛋白整个开放阅读框(open reading frame)，用Klenow片断(Promega)将此840 bp片断两端填平，再用T4 DNA 连接酶(TaKaRa)在片断两端连上Sal Ⅰ 连接子(上海生工)，而后经SalⅠ (TaKaRa)酶切使其两端生成Sal Ⅰ粘性末端，再将其克隆到本室改建的真核细胞地塞米松诱导表达载体pMAMneo-amp^-［4］多克隆位点的SalⅠ切点上，最后经Nhe Ⅰ(TaKaRa)酶切(在载体多克隆位点的目的片段插入的Sal Ⅰ位点上游及插入片断的内部第622位碱基处分别有一Nhe Ⅰ切点)并对酶切图谱进行分析，反向插入的重组子经NheⅠ酶切后应该出现228 bp及9 kb二条带。

二、细胞转染及筛选

人羊膜FL细胞由本室提供，贴壁生长于含10%小牛血清(GIBCO BRL)及青、链霉素的MEM(GIBCO BRL)培养液中。用改良的磷酸钙法^［5］将构建好的表达CROC-1反义RNA的真核细胞表达重组质粒20～30 μg转染培养的FL细胞，在37℃、5%CO₂条件下用含G418(400 μg/mL)的MEM全培养液进行筛选培养，每隔2～3 d换1次液。同时用空载体pMAMneo-amp^-转染FL细胞，以建立FL-MAMneo细胞系作为载体对照。

三、细胞生长曲线测定

将FL、FL-MAMneo及FL-CROC-1^- 细胞分别以3×10⁴ cells/mL种于24孔培养板，每种细胞6组，每组4个复孔，用含G418(G418工作浓度为200 μg/mL, 适用于FL-MAMneo及FL-CROC-1^- 细胞)或不含G418(适用于FL细胞)的MEM全培养液(含地塞米松，工作浓度为10^-5 mol/L，用于诱导重组质粒pMAM-antiCROC-1表达CROC-1反义RNA)于37℃、5%CO₂条件下培养24 h，从第2 d开始每天计数，共计6 d。

结果

一、CROC-1反义RNA表达重组质粒pMAM-antiCROC-1的建立

从pBS-C1B上切出的840 bp长Croc-1B cDNA片断，重组到pMAMneo-amp^-多克隆位点的Sal Ⅰ切点上后得到的重组质粒，经Nhe Ⅰ 酶切，酶切产物琼脂糖胶电泳后发现，其中的一个重组质粒出现228 bp及9 kb二条带，说明该重组质粒就是反向插入的表达CROC-1反义RNA的表达重组质粒pMAM-antiCROC-1(见图1、图2)。

Fig 1Physical map of theCROC-1 antisense RNA expression recombinant plasmid pMAM-anti CROC-1

The 840 bp length CROC-1 cDNA fagment was inserted into the Sal Ⅰ site of the plasmid pMAMneo-amp^- in antisense orientation

1CROC-1反义RNA重组表达质粒pMAM-antiCROC-1的物理图谱

Fig 21% agarose gel electrophoretic analysis of the recombinant plasmid digested with restriction endonucleases

Lane 1: GeneRuler^TM 100 bp DNA Ladder(MBI); lane 2: recombinant plasmid digested with Nhe Ⅰ (show 9 kb and 228 bp fragments); lane 3: recombinant plasmid digested with SalⅠ(show 840 bp fragment); lane 4: parental plasmid pMAMneo-amp^- digested with SalⅠ; lane 5: λDNA /Hind III Marker(MBI)

2重组质粒经限制性内切酶消化后1%琼脂糖凝胶电泳分析

二、FL-CROC-1- 细胞系的建立

pMAM-antiCROC-1、pMAMneo-amp^-分别转染的FL细胞，经G418筛选培养，3周后分别得到10多个抗G418的细胞集落，而后换以维持性培养液(G418 200 μg/mL)继续培养并扩大成FL-CROC-1^-、FL-MAMneo细胞系，冻存备用。

三、细胞生长曲线测定结果

Fig 3 The growth curve of<