［摘要］目的：研究多重耐药性(MDR1)基因及其产物P糖蛋白(P-gp)与容积激活性Cl^-电流的关系。方法：用膜片钳全细胞记录技术记录牛眼睫状体非色素上皮(NPCE)细胞容积激活性Cl^-电流，反义寡核苷酸阻抑细胞MDR1基因表达，在激光共聚焦显微镜下检测细胞P-gp免疫荧光。结果：P-gp免疫荧光与人源反义MDR1呈剂量依赖性减弱关系,容积激活性Cl^-电流被人源反义MDR1特异性地部分阻抑，电流潜伏期延长，峰电流值减少，电流抑制率与人源反义MDR1呈现剂量依赖性增强关系,(r=0.99， P＜0.01)。 P-gp表达抑制率和容积激活性Cl^-电流抑制率高度正相关(r=0.99， P＜0.01)。结论：MDR1基因及其产物P-gp参与NPCE细胞容积激活性Cl^-电流的形成。

［中图分类号］Q 25［文献标识码］A

［文章编号］1000-4718(2000)07-0658-05

Multidrug-resistance antisense inhibits volume-activated chloride

current in non-pigmented ciliary epithelial cells

CHEN Li-xin, Wang Li-wei

(Department of Physiology, Guangdong Medical College, Zhanjiang 524023, China)

［Abstract］AIM： To study the relationship between multidrug-resistance (MDR1) gene product P-glycoprotein (P-gp) and the volume-activated chloride current. METHODS:The volume-activated chloride current in bovine non-pigmented ciliary epithelial cells was recorded using a whole cell recording technique. An antisense technique was used to inhibit the expression of MDR1 gene. The immunofluorescence of P-gp was monitored with a real-time laser confocal microscope.RESULTS:P-gp immunofluorescence correlated negatively with the concentration of the human MDR1 antisense oligonucleotide. The antisense oligonucleotide inhibited the volume-activated chloride current specifically and partially. The latency of activation of the current increased and the peak current decreased. The percentage of inhibition of peak current correlated positively to the concentration of the antisense oligonucleotide(r＝0.99, P＜0.01) and to the reduction(%) of P-gp immunofluorescence(r=0.99,P＜0.01).CONCLUSION:P-gp, the product of MDR1 gene, plays an important role in the activation pathway of volume-activated chloride current in non-pigmented ciliary epithelial cells.

［MeSH］Ion channels; Oligonucleotides, antisense; Drug resistance; Gene expression

睫状体非色素上皮(non-pigmented ciliary epithelium, NPCE)细胞分泌房水机制与细胞容积调节有关。NPCE容积激活性Cl^-通道起着调控房水分泌速率的重要作用^［1］。资料表明,多重耐药性(multidrug-resistance， MDR1)基因可能参与容积激活性氯电流的形成^［2］。MDR1基因产物P糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)在容积激活性氯电流的形成中的作用如何仍未确定。本研究用基因阻断技术(antisense technique)阻断NPCE的MDR1基因表达,观察容积激活性氯电流的改变,以阐明二者之间的关系。

材料和方法

一、细胞分离和培养

睫状体上皮细胞分离和培养的方法见文献^［3］。

二、反义寡核苷酸处理细胞

本实验所用鼠源和人源两种MDR1反义寡核苷酸(MDR1 antisense oligonucleotide,反义MDR1，Severn Biotech Ltd, UK)用高效液相层析法提纯，其序列详见文献^［3］。用阳离子脂质体lipofectin (Gibco BRL, USA)促进细胞摄取反义寡核苷酸。

实验分组:空白对照组;阳离子脂质体组(lipofectin 20 mg/L);鼠源反义MDR1组(M-LA; lipofectin 20 mg/L和鼠源反义MDR1各10、50、100、200 mg/L);人源反义MDR1组(H-LA; lipofectin 20mg/L和人源反义MDR1各10、50、100、200 mg/L)。各处理组分别在E199培养液中加入上述药物,培养48 h 后, 进行P-gp免疫荧光标记和测定,记录全细胞电流。

三、P-gp免疫荧光测定

用免疫荧光法检测P-gp的水平，以了解反义MDR1阻抑MDR1基因的程度。细胞培养、处理48 h后，磷酸盐(PBS)溶液漂洗细胞，聚甲醛固定，Triton X-100浸浴，羊血清封闭，JSB-1阳性对照组和处理组加入小鼠抗P-gp抗体JSB-1 (Monosan, Netherlands), 置于冰箱中过夜(14～16 h)。JSB－1阴性对照组不加抗体JSB－1。加入FITC标记的羊抗鼠Ig-G(Sigma)，置暗处孵育1 h，在激光共聚焦显微镜(Noran Instruments, USA)下检测荧光，用metamorph图像分析系统(Universal Imaging Corporation, USA )拍摄、分析图像，荧光强度(灰白度)单位：Unit，0 Unit最弱，255 Unit最强。

四、全细胞记录

用EPC-7膜片钳放大器(list electronic, Germany)记录单独的NPCE细胞全细胞电流。微电极尖端电阻5～10 MΩ。电流和电压信号用CED1401(Cambridge, UK)数字化(采样频率3 kHz)，实验数据用EPC(CED, Cambridge, UK)软件分析。钳制电压模式：细胞被钳制在0 mV, 以0, ±40, ±80 mV不断反复循环，每个钳制脉冲波宽200 ms，间隔4 s。细胞玻片安放在灌流槽中，用等渗液灌流5 min, 记录稳定的背景电流，改灌低渗液，待电流升高7 min后，重新灌流等渗液，连续观察和记录电流。实验在室温(20～24℃)下进行。

五、溶液

使用特配的溶液以记录Cl^-电流。电极液含(mmol/L):105 N-methyl-d-glucamine chloride (NMDG-Cl), 1.2 MgCl₂, 10 Hepes, 1 EGTA, 70 D-manitol, 2 ATP。等渗灌流液含(mmol/L):105 NaCl, 0.5 MgCl₂, 10 Hepes, 70 D-manitol。 低渗灌流液除不含D-manitol外，其它成份及浓度与等渗灌流液相同。电极液和等渗灌流液用蔗糖调至渗透压300 mOsm/L,低渗灌流液调至230 mOsm/L。电极液和灌流液用Tris液分别调至pH 7.25和7.40。

六、统计方法

数据以均数±标准差(±s)表示，均数差异显著性用t检验判定。

结果

一、P-gp免疫荧光

在激光共聚焦显微镜下，P-gp特异抗体JSB-1阴性对照组细胞只显示微弱的自发荧光(14.7±12.9，n=46)。而JSB-1阳性对照组细胞(91.4±26.9，n=53)和lipofectin组细胞(87.0±23.5，n=48)显示较强的荧光,两组荧光值没有显著差异，表明NPCE细胞存在P-gp蛋白，lipofectin对MDR1基因表达没有影响。鼠源反义MDR1组细胞的荧光值(M－LA200； 95.2±25.3， n=22)与JSB-1阳性对照组无显著差异(P＞0.05)。人源反义MDR1组P-gp荧光明显弱于阳性对照组，并且随着反义MDR1浓度增加，P-gp荧光逐渐减弱(图1),两者高度负相关(r=-0.94， P＜0.01), H－LA 200组P-gp荧光弱至30.7±27.1,表明人源反义MDR1有效地抑制NPCE细胞MDR1基因表达,减少其产物P-gp蛋白合成,而且减少的程度与反义MDR1浓度有关。而鼠源反义MDR1则无此作用。

Fig 1Dose-dependent reduction of P-gp immunofluorescence caused by human MDR 1-antisense (±s) (n)

1人源反义MDR1对P-gp免疫荧光的剂量依赖性抑制作用

二、全细胞电流

(一)容积激活性Cl^-电流如图2A所示,对照组细胞被钳制在0,+40,-40, +80, -80 mV(钳制电压模式见2C),在等渗液灌流期间仅记录到微弱的背景电流,在12个细胞上观测到相同的结果。然而，以230 mOsm/L的低渗液灌流时,记录到一个几乎不失活、持续、较大的电流，其外向电流(向上)和内向电流(向下)均显著增加,但外向电流占优势。2B显示低渗液灌流9 min瞬时记录的电流。图2D显示实验全过程电流变化(在每个钳制脉冲第10 ms处采样)。在低渗液灌流1～3 min后,电流开始上升,持续灌流低渗液,电流持续增加,电流上升5～7 min后,上升速度减弱趋向平稳,将上升7 min时的电流值作为峰电流。重新灌流等渗液时,电流逐渐衰减,直至基本恢复到低渗液灌流前的对照水平,恢复时间大约10～30 min。

在等渗液灌流10 min和低渗液灌流产生电流后7 min记录电流,作电流-电压曲线(2E)。由于电极液和灌流液两种液体均不含K⁺，Cl^-浓度几乎完全相等,氯离子平衡电位(E_Cl)等于零。测得低渗液激活的电流在(-4.9±0.5) mV反转,很接近氯离子平衡电位。Cl^-通道阻断剂tamoxifen基本阻断此电流(阻抑率87.6％, n=5，P＜0.01),因此,Cl^-是形成此电流的主要离子(详见讨论)，此电流是容积激活性Cl^-电