［摘要］目的：检测大鼠心脏容量超负荷(volume overload，VOL)时左心室内压变化诱导心肌原癌基因c-fos、c-jun、c-myc 、egr-1 mRNA表达的时间变化规律。方法：测定VOL 、假手术对照组大鼠术后30 min、1、4、6、12及48 h左心室收缩压(LVSP)和舒张末压(LVEDP)，用狭缝杂交检测2组各时间左室心肌原癌基因表达，用密度仪进行定量分析。结果:VOL大鼠术后LVSP显著低于假手术组(P＜0.05)，48 h最低；术后30 min LVEDP高于假手术组(P＜0.05)，12 h最高，48 h与假手术组相近(P＞0.05)；假手术组和阴性对照各原癌基因无阳性表达，AVF后1 h检测到c-fos 、c-jun、egr-1 mRNA表达，4h检测到c-myc表达，均于4h出现表达峰值，此后减弱，48h c-fos无表达，c-jun表达较弱，c-myc和egr-1仍有较高表达。结论：VOL大鼠LVEDP增加，首先诱导c-fos、c-jun、egr-1表达，c-myc表达较晚，c-myc、c-jun、 egr-1表达持续时间较长，可能反映了活体VOL刺激心肌原癌基因表达时间变化规律；当室壁受到一定程度和一定时间的负荷牵拉后心肌原癌基因即开始表达，负荷的强弱可能并非重要因素。

［中图分类号］ Q754； K346.1［文献标识码］ A

［文章编号］1000-4718(2000)07-0592-04

Correlation between intraventricular pressure and early

phase proto-oncogene expression in volume overload rats

HU Xiao-ping

(Department of Pathology, Punan Hospital, Shanghai 200125, China)

LI He，ZHANG Guo-yuan， WU Zong-gui

(Department of Cardiology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)

FEI Jian

(Shanghai Institute of Cell Biology, Chinese Academy of Science, Shanghai 200031, China)

［Abstract］AIM: To investigate the effect of intraventricular pressure change by volume overload (VOL) on expression of proto-oncogene c-fos,c-jun,c-myc and egr-1. METHODS: Left ventricular systolic pressure(LVSP) and left ventricular end diastolic pressure (LVEDP) of rat with VOL induced by aortacaval fistula operation and rats of control group were measured at 30 min, 1, 4, 6, 12 and 48 h after the operation,these mRNAs at the foregoing time points were measured by slot bloting method and quantified with densitometry. RESULTS: Be compared with the control group, VOL rats LVSP decreased (P＜0.05) and declined most remarkably at 48 h,LVEDP elevated significantly at 30 min (P＜0.05), reached a maximal value at 12 h and the levels of control group at 48 h (P＞0.05) after the operation.The proto-oncogene expression signals were not detected in the control,negative controls and VOL rats at 30 min after the operation. The c-fos,c-jun and egr-1 mRNA signals appeared earlier,at 1 h, and c-myc mRNA increased later at 4 h.All reached peak value at 4 h and then declined gradually.The c-fos mRNA were not detected at 48 h. The c-myc,c-0jun and egr-1 mRNA persisted throught the entire observation period from 1 h to 48 h. CONCLUSIONS: During VOL early phase the overload have effect on expression of the proto-oncogene mRNA,c-fos,c-jun and egr-1 mRNA appear earlier, c-myc later,egr-1,c-jun and c-myc persist longer period, but the expressions do not strengthen with the ventricule wall load increase.This sequential induction pattern may reflect the time course regularity of the proto-oncogenes expression induced by VOL,and indicate the proto-oncogenes expression initiate while the heart load accumulate some extent and duration and the load magnitude may not play a critical role.

［MeSH］Ventricular function; Proto-oncogenes; Gene expression

长期血流动力学负荷增加心脏将发生代偿性心肌肥厚，然而左心室肥厚又是发生心力衰竭、心肌梗塞和猝死的独立危险因素。原癌基因编码的蛋白—生长因子、生长因子受体、细胞内信息传递器及核转录因子对细胞生长、增殖、分化发挥重要作用。已经证明，心肌肥厚发生过程极早期多种原癌基因有短暂表达，对调节心脏特异性基因的转录及心肌肥厚的发生可能起重要作用。心脏对不同刺激的应答—心肌原癌基因表达表现出刺激特异性以及不同的时间、空间次序^［1～4］，这对其下游特异性基因表达和心肌肥厚的发生可能有特殊意义。目前对心脏超负荷诱导成年哺乳动物心肌肥厚的早期分子和细胞变化还不完全清楚，对活体容量超负荷(VOL)诱导心肌原癌基因表达的研究较少，国内尚无研究报告。因此，我们用核酸杂交的方法检测大鼠活体心脏VOL早期左心室压力与3个不同家族的转录因子：亮氨酸拉链(leucine zipper)结构c-fos、c-jun，锌指(zinc finger)结构egr-1和螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix)结构c-myc心肌原癌基因表达时间变化规律。

材料和方法

一、大鼠容量超负荷模型建立

雄性Wistar大鼠(体重：200～250 g)，参照Garcia等的方法^［6］，以18G针头进行腹主动脉－腔静脉穿刺建立动静脉瘘(aortavena caval fistula，AVF)。为减少手术对原癌基因表达的影响，尽可能缩短手术时间 ，VOL大鼠(n=4)完成AVF时间为5～9min。假手术对照组(n=4)除不进行穿刺外处理步骤相同。二组大鼠分别于术后30 min、1、4、6、12、48 h参照Litwin等的方法^［7］左心室穿刺，用HP78560A型中心监测仪(Hewlett Packard CO,USA)检测左心室收缩压(left ventricular systolic pressure, LVSP)和舒张末压(left ventricular end-diastolic pressure, LVEDP)。心室压力检测后处死动物，迅速取出心脏，分离左心室，液氮中速冻后转移至-70℃冰箱中保存。

二、mRNA检测

使用TRIzol(GibcoBRL)抽提左心室心肌总RNA，用紫外分光光度计以260 nm进行定量。按标准方法^［8］进行狭缝杂交。以β-actin为内对照、酵母tRNA为阴性对照。大鼠c-fos、c-jun、c-myc、egr-1、β-actin mRNA寡核苷酸探针：c-fos 5′-CAAGT TGATC TGTCT CCGCT CGTAT CTGTC-3′；c-jun 5′-GATGT GCCCA TTGCT GGACT GGATG ATCAG-3′；c-myc 5′-TTGTT CTTCT TCAGA GTCGC TGCTG GTGGT -3′；egr-1 5′-TGGGA GGCAG AGGAA GACGA TGAAG CAGCT-3′；β-actin 5′-CCTAG AAGCA TTTGC GGTGC ACGAT GGAGG-3′(由中科院上海细胞生物学研究所基因工程实验室合成)。用T4多聚核苷酸激酶(Promega CO.)、［³² P-γ］ATP(Amersham CO.)进行5′端标记寡核苷酸探针，标记后比活性为10⁹ counts*min^-1*μg^-1。用狭缝杂交板转膜(Hybond-N,Amersham)后，加入探针，55℃杂交16 h后洗膜、进行放射性自显影。用电脑图象分析仪检测杂交信号的相对光密度(IOD)。每组实验重复三次，计算上述原癌基因mRNA杂交信号与内对照β-actin mRNA IOD的比值，所有检测结果用此比值表示，以各组最早的阳性表达为100%。

三、数据分析

试验数据以均值±标准差(±s)表示，用Bonferroni t和Student t检验判断均数差异显著性。

结果

一、AVF术后大鼠左心室LVSP和LVEDP变化时间过程(图1)

VOL组大鼠AVF后30 min LVSP低于对照组29%(P＜0.05)， 48 h低于对照组42%(P＜0.05)，LVEDP术后30 min高于对照组283%(P＜0.05)，12 h为700%(P＜0.05)，48h接近对照组水平(P＞0.05)。

Fig 1 Showing the time point changes of LVP after the AVF

±s, n=4; * P＜0.05, vs control;

# P＜0.05, vs other after AVF

1AVF术后左心室压力变化

二、VOL大鼠心肌c-fos、c-jun、c-myc和egr-1 mRNA表达变化时间过程(表1、图2)

AVF后30min未检测出各原癌基因表达，均于术后4 h出现表达峰值。术后1 h c-fos mRNA可见微弱表达，4h表达增强，为1h的547%(P＜0.05)，6h为234%(P＜0.05)，12h表达水平与1h相近，48h无表达；同样，AVF后1h c-jun mRNA表达较弱，4h表达为1h的578%(P＜0.05)，6h为150%(P＞0.05)，12h表达水平与1h接近，48 h为1 h的181%(P＜0.05)；术后1 h检测到egr-1 mRNA表达，4 h表达为前者336%(P＜0.05)，此后6、12、48 h表达水平增强分别为1 h的166%、297%(P＜0.05)、259%(P＜0.05)；术后30