［摘要］目的和方法：为了研究DNA损伤剂N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)诱发vero细胞非定标性突变发生的信号转导机制，我们观察了MNNG诱发vero细胞c-Jun NH₂-terminal kinase/stress activated protein kinase(JNK/SAPK)通路激活的情况：分别用Western印迹法和固相激酶活性测定法检测JNK1磷酸化和JNKs激酶活性。结果：发现用0.2 μmol/L MNNG和1 mg/L放线菌素酮(CHM)分别处理vero细胞2.5 h和1 h后，都引起细胞抽提液中磷酸化JNK1的比例明显增高。同时通过测定JNKs的底物c-Jun的磷酸化程度，发现这两种处理也都可引起JNKs激酶活性显著增高(分别增高6.7和3.0倍)。结论：证明0.2 μmol/L MNNG和1 mg/L CHM分别处理vero细胞2.5 h和1 h都可引起vero细胞内JNK/SAPK通路被激活。

［中图分类号］ Q257［文献标识码］ A

［文章编号］1000-4718(2000)06-0481-05

Activation of JNK/SAPK pathway in vero cells induced by N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine

LU Jing, YU Yin-nian, XIE Hai-yang

(Department of Pathophysiology, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310031, China)

［Abstract］AIM and METHODES: To evaluate the possible signal transduction mechanism of nontargeted mutagenesis in vero cells induced by DNA damaging agent N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine(MNNG),the activation of c-Jun NH₂-terminal kinase/stress activated protein kinase(SAPK/JNK) pathway in vero cells induced by MNNG was studied. Western Blot analysis and Solid-phase kinase assay were used to measure the phosphorylation of JNK1 and kinase activity of JNKs, respectively.RESULTS: After 0.2 μmol/L, 2.5 h MNNG or 1 mg/L, 1 h cycloheximide (CHM) treatment, the proportion of phosphorylated JNK1 in cell extract increased significantly, simultaneously the kinase activity of JNKs increased dramatically(6.7 and 3.0 folds respectively), as measured by the phosphorylation of c-Jun, a substrate of JNKs.CONCLUSION: Both 0.2 μmol/L 2.5 h MNNG and 1 mg/L 1 h CHM treatment can induce the activation of JNK/SAPK pathway, one of the stress signal transduction pathways, in vero cells.

［MeSH］Nitrosoguanidines; Blotting, Western; Phosphotransferases, ATP

在对哺乳类细胞非定标性突变发生机制的研究中，我们已经证明DNA烷化剂N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)诱导猴肾vero细胞产生的非定标性突变有一定的时相特征。转录和释译抑制剂处理，放射性同位素标记磷酸化蛋白质等一系列实验提示非定标性突变的形成有细胞信号转导通路的介入^［1，2］。用Western印迹法发现0.2 μmol/L MNNG处理vero细胞2.5 h后以及处理2.5 h后再常规培养12 h都可引起45 kD蛋白质酪氨酸磷酸化程度增高，1 mg/L 放线菌素酮(cycloheximide, CHM)处理12 h也可引起45 kD蛋白质酪氨酸磷酸化程度增高^［3］，直接提示MNNG处理vero细胞可能诱发应激相关信号转导通路的激活。

c-Jun N-末端激酶(c-Jun NH₂-terminal kinase, JNK)/应激活化蛋白激酶(stress activated protein kinase, SAPK)是一类近年来被深入研究的应激反应性蛋白激酶^［4］，其中的JNK1分子量为46 kD。许多外界应激原都可以使JNKs/SAPKs磷酸化而活化，JNKs/SAPKs可使转录因子(如c-jun)磷酸化，实现对基因的调控^［5］。为探讨本实验室用来诱导vero细胞产生非定标性突变的条件能否激活JNK/SAPK信号转导通路，本实验用Western印迹法(Western blot)和固相激酶活性测定法(solid-phase kinase assay)在不同的时点分别观察了MNNG和CHM处理所引起的vero细胞JNK1磷酸化程度和JNKs的激酶活性的改变。

材料和方法

一、细胞培养

猴肾vero细胞在DMEM(Dulbeccos modified eagle medium)培养基(Gibco BRL)中(含10% V/V小牛血清，100 kU/L青霉素，100 mg/L链霉素，200 mg/L卡那霉素)常规贴壁培养，当细胞处于对数生长期，贴壁面积达80%汇合时分组处理。

二、N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)及放线菌素酮(CHM)处理细胞

MNNG处理：分为4组：用含0.2 μmol/L MNNG(Sigma)的无血清DMEM培养基处理vero细胞1 h(标为M_1（0）组)和2.5 h后，换以新鲜DMEM全培养基，继续培养0，6，12 h(分别标为M_2.5(0)，M_2.5(6)，M_2.5(12)组)，在4个不同时点收集细胞。对照组除用MNNG溶液的溶剂二甲基亚砜(DMSO)(0.2% V/V)代替MNNG以外，其余处理相同(分别标为D_1（0），D_2.5(0)，D_2.5(6)，D_2.5(12)组)。

CHM处理：分为3组：用含1 mg/L CHM(Sigma)的无血清DMEM处理vero细胞1， 6，12 h后收集细胞(标为C_１，C_６，C₁₂组)。其对照用CHM的溶剂Hanks液(0.1% V/V)代替CHM，其余处理相同(分别标为H_１，H_６，H₁₂组)。

三、全细胞抽提液的制备及蛋白浓度测定

各组细胞收集完毕，用细胞裂解液^［6］(25 mmol/L HEPES(pH 7.7),0.3 mol/L NaCl, 1.5 mmol/L MgCl₂,0.2 mmol/L EDTA,0.1 mmol/L Na₃VO₄, 20 mmol/L β-glycerophosphate, 1% V/V Triton-X-100, 0.5 mmol/L DTT, 2 mg/L leupeptin, 100 mg/L PMSF)4℃裂解细胞45 min,15 600×g 4℃离心30 min后，上清(即全细胞抽提液)分装，储于-70℃备用。用改良Lowry法^［3］测各组全细胞抽提液中蛋白质总浓度。

四、Western印迹^［7］

各组全细胞抽提液加上样缓冲液(终浓度为62.5 mmol/L Tris-HCl(pH 6.8)，2% W/V SDS， 50 mmol/L DTT,7.5% V/V glycerol)后加样进行蛋白质SDS聚丙烯酰胺凝胶电脉(SDS-PAGE)(5% W/V积层胶，10% W/V分离胶)。SDS-PAGE结束后，将凝胶上蛋白质电转移至硝酸纤维素膜(NC膜Amersham)。NC膜用TBS(10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0),150 mmol/L NaCl)漂洗后，加Blotto A(含5% W/V milk,0.05% V/V Tween-20的TBS)室温缓摇20 min，弃Blotto A,加含0.5 mg/L抗JNK1兔多克隆IgG(Santa Cruz Biotechnology)的Blotto A室温缓摇60 min,用TBST(含0.05% V/V Tween-20的TBS)洗NC膜后加含0.75% V/V羊抗兔IgG-HRP(华美)的Blotto A室温缓摇45 min,用TBST和TBS洗膜后进行增强化学发光(ECL)反应60 s，压片后取出胶片进行显影和定影。由于磷酸化JNK1和非磷酸化JNK1的电泳迁移率不同^［8］，可用Kodak 1D analysis 2.0软件对各组的磷酸化JNK1(P)和非磷酸化JNK1(N)条带进行光密度扫描，计算各组磷酸化JNK1光密度占非磷酸化JNK1光密度的百分比(P/N)，把各对照组与相应处理组的P/N进行比较，对照组的P/N定为1.0，相应处理组P/N与前者相比的倍数为相对P/N光密度值。

五、固相激酶活性测定^［6］

细胞抽提液被稀释成终浓度为20 mmol/L HEPES(pH 7.7)，75 mmol/L NaCl,2.5 mmol/L MgCl₂, 0.1 mmol/L EDTA, 0.1% V/V Triton X-100, 0.5 mmol/L DTT, 20 mmol/L β-glycerophosphate,0.1 mmol/L Na₃VO₄, 2 mg/mL leupeptin,100 mg/mL PMSF。取适当体积的细胞抽提液(使其蛋白质含量为50μg)，加入5μg GST-c-Jun(79)-agarose(Santa Cruz Biotechnology)4℃孵育3 h，离心后沉淀用0.5 mL 4℃HEPES binding buffer(20 mmol/L HEPES (pH 7.7),50 mmol/L NaCl,2.5 mmol/L MgCl₂,0.1 mmol/L EDTA,0.05% V/V Triton X-100)洗4遍，沉淀重悬于15μL kinase buffer(20 mmol/L HEPES(pH 7.7),20 mmol/L MgCl₂,20 mmol/L β-glycerophosphate,20 mmol/L p-nitrophenyl phosphate,0.1 mmol/L Na₃VO₄,2 mmol/L DTT,20μmol/L ATP, 9.25×10⁴ Bq［γ-³²P］ATP),30℃孵育25 min，离心后沉淀用0.5 mL 4℃HEPES binding buffer洗4遍，加上样缓冲液变性后离心，取上清进行SDS-PAGE。电泳结束后进行干胶，最后胶压储磷屏(storage-phosphoscreen,Packard)3.5 h，用Kodak 1D analysis 2.0软件对储磷屏上37 kD的GST-c-Jun(79)条带进行光密度扫描，以对照组的光密度为1.0，相应处理组的光密度为相对光密度。

结果

一、JNK1磷酸化测定

由图1可见：3个时间点的MNNG处理组(M_1（0）,M_2.5(6),M_2.5(12)组)和各自对照组(D₁₍₀₎,D_2.5(6),D_2.5(12)组)相比，JNK1的磷酸化程度无明显变化：M₁₍₀₎,M_2.5(6),M_2.5(12)的相对P/N光密度值分别为1.07,0.99,0.99。而M_2.5(0)组与其对照组D_2.5(0)相比，JNK1的磷酸化程度明显增高：