［摘要］目的:观察碱性成纤维细胞生长因子对血管内皮细胞β₁整合素表达的影响。方法:采用Western Blot法结合图像处理分析,检测bFGF作用前后培养血管内皮细胞β₁整合素的表达。结果:bFGF处理组和对照组平均灰度值分别为166.11±9.86和175.32±5.12，两组免疫酶显色有显著差异。结论:bFGF能够诱导内皮细胞膜表面β₁整合素合成增加。推测bFGF通过上调内皮细胞β₁整合素表达，可能在促进血管生成方面有重要作用。

［中图分类号］Q786［文献标识码］A

［文章编号］1000-4718(2000)06-0519-03

Effect of bFGF on expression of endothelial cell integrin β₁ subunits

ZHOU Xu-long

( Dept. of Pathology, Medical College of Jinan University, Guangzhou 510632, China)

DENG Yi-ping

(Dept. of Histology and Embryology, Sun Yat-Sen University of Medical Science, Guangzhou 510089, China)

［Abstract］AIM： To study the effect of basic fibroblast growth factor(bFGF) to the expression of integrin β₁ subunit of endothelial cells. METHOD: The expression of integrin β₁ subunit of endothelial cells was determined before and after bFGF treatment with Western Blot and immage analysis method.RESULTS: The mean gray value of immunostain by immage analysis method is 166.11±9.86 in the experimental group and 175.32±5.12 in the control group, suggested that bFGF may upregulate expression of integrin β₁ subunits of endothelial cell. CONCLUSION: bFGF may play an important role in angiogenesis by way of inducing the overexpression of endothelial cell integrin β₁ subunits.

［MeSH］Fibroblast growth factor,basic; Integrins;Neovascularization

血管生成是胚胎发育中的必然过程，也是组织损伤修复、炎症、类风湿、糖尿病视网膜病、肿瘤的生长和转移等病变过程中的重要一环。血管生成受许多因素的影响，其中碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)起重要的促进作用。实验证明bFGF在促进血管生成方面具有多方面效应，但这种多效作用的机制目前尚不完全清楚。本文采用Western Blot法结合图像处理分析，观察bFGF对血管内皮细胞β₁整合素表达的影响，试图阐明bFGF促进血管生成的作用机制。

材料和方法

一、主要试剂

bFGF(珠海东大生物制剂公司),抗β₁整合素抗体、辛基-β-D-吡喃糖苷(octyl-β-D-glucopyranoside)、苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)、抑肽酶、标准分子量蛋白等均购自Sigma公司。

二、主要器材

SCR-6型稳流稳压电泳仪(江苏江阴无线电一厂)，DYY-Ⅲ28型垂直电泳槽、DYY-Ⅲ40B型电泳槽(均为北京六一仪器厂)，GL-20A型低温高速离心机(湖南医疗仪器厂)，图像处理分析系统(德国，Kontron IBAS 2.0)。

三、血管内皮细胞的培养与鉴定

长白与大白杂交良种小猪(华南农大荔山种猪场提供)，按本室常规方法取主动脉内皮细胞，含15%胎牛血清的M199培养液原代培养并传代,倒置显微镜下形态学鉴定以及内皮细胞Ⅷ:Ag的免疫组化染色鉴定。

四、bFGF对内皮细胞β₁整合素表达的影响

(一)内皮细胞膜蛋白的提取参考Glyman的方法^［1］。传代培养第4～5代融合状态内皮细胞，实验组每瓶加含100 ng/mL bFGF的无血清M199培养基2 mL，对照组用无血清M199培养液2 mL, 5% CO₂、37℃培养18 h。625 mg·L^-1胰酶-100 mg·L^-1 EDTA混合液消化细胞1～2 min，加D-Hanks液2 mL，4℃低温条件下用细胞刮刮下细胞后,将细胞悬液并入离心管。离心1 500 r/min, 5 min,弃上清。加预冷的细胞裂解液(含辛基-β-D-吡喃糖苷50 mmol/L、PMSF 1 mmol/L、抑肽酶2 mg/L、硫酸锰1 mmol/L、Triton X-100 1%、叠氮钠0.2 g/L, 用50 mmol/L pH 7.4 Tris-HCl缓冲液配制)，4℃裂解细胞1 h。低温离心2次，分别为2 500 r/min,15 min和14 000 r/min,30 min，弃沉渣。上清蛋白质溶液经4℃、0.05 mol/L pH7.6-HCL缓冲液透析48 h，再用聚乙二醇将其浓缩，考马斯亮蓝G250法测定实验组和对照组蛋白质溶液浓度。

(二)SDS-PAGE电泳配制8%分离胶。上样,每孔槽内确保所加样品的蛋白质的总量相等。然后进行电泳，浓缩胶用恒流10 mA，分离胶用恒流18 mA。结束电泳后，将凝胶切成两半，一半做银染，另一半做蛋白质印迹和免疫酶显色。

(三)蛋白质印迹和免疫酶显色参考《分子克隆实验指南》^［2］中方法进行。将滤纸、硝酸纤维素滤膜、凝胶叠放好后，4℃冰箱中恒流60 mA电转移14 h,卸下电泳装置后,将硝酸纤维素滤膜放入培养皿中晾干30～60 min后,加入封闭液，置摇床上室温平缓摇动温育1～2 h,再加含抗β_１整合素第一抗体的封闭液（抗体按1∶200配），放摇床4℃平缓摇动过夜，用PBS洗膜3次，每次10 min，加含第二抗体的封闭液（抗体按1∶500配），置摇床上室温平缓摇动1 h，PBS洗膜3次后加DAB显色液，放摇床上平缓摇动，待蛋白条带显色后，用PBS洗膜终止显色，再将滤膜与另一半做银染凝胶比较，确定显色条带的分子量位置，并拍照做永久保存。

(四)图像处理分析将硝酸纤维素膜在IBAS图像处理系统中测实验组和对照组显色条带的面积和平均灰度值。实验重复2次，比较bFGF处理组和对照组的显色差别。

结果

内皮细胞原代培养72～96 h，细胞呈扁平、多边形，细胞境界不清楚，相互呈典型鹅卵石样镶嵌排列，见图1。内皮细胞Ⅷ:Ag的免疫组化染色呈阳性反应，胞浆内含棕黄色阳性反应物质。SDS-PAGE电泳结果见图2。蛋白质转印和免疫酶反应可见在分子量94 kD和116 kD之间有1条阳性反应显色条带，符合整合素β₁亚单位的分子量范围。实验重复3次，结果相似，见图3。用IBAS图像处理系统对两条显色条带进行灰度值测定，bFGF处理组和对照组的平均灰度值分别为166.11±9.86和175.32±5.12,两组间有显著差别(P＜0.05)。

Fig 1 Primary cultured endothelial cells in confluence (×100)

1 原代培养已生长融合的内皮细胞

Fig 2SDS-PAGE electrophoresis for the extraction of endothelial cells

Lane A: bFGF group; Lane B: control group； Lane C: molecular mark

2 内皮细胞蛋白提取物的SDS-PAGE凝胶电泳

Fig 3Immunostain for the Western Blot nitrocellulose filter

Lane A: bFGF group;Lane B: control group

3 蛋白质印迹的免疫酶显色

讨论

bFGF是迄今发现的促内皮细胞增殖作用最强的生长因子,很多中胚层来源细胞以及内皮细胞本身都可分泌bFGF^［3］。bFGF属单链糖蛋白，分子量16～18 kD。局部组织细胞产生的bFGF以自分泌和旁分泌的形式维持内皮细胞的生长，并能够和基膜细胞外基质（extracellularmatrix,ECM）中的硫酸乙酰肝素结合，以结合型的形式储存在组织中。当组织损伤时，基膜ECM受破坏，原结合的bFGF游离出来，可刺激内皮细胞增殖分化，起促进组织修复的作用^［4］。bFGF引起的内皮细胞效应是多方面的。据检测，牛主动脉内皮细胞上有亲合率很高的bFGF受体，约3 000个/每个细胞，且bFGF与细胞膜受体的亲合率很高^［5,6］。因此局部组织中微量浓度的bFGF即可引起内皮细胞明显的反应。bFGF引起内皮细胞效应表现出多效性的特点:bFGF有显著的致内皮细胞分裂效应；能促使内皮细胞在ECM上的粘附和迁移；能促进内皮细胞合成ECM成分；bFGF还具有趋化作用，当组织损伤时，内皮细胞的迁移方向与bFGF的浓度梯度呈正相关。目前有关bFGF引起内皮细胞各种效应的研究已有较多报道，但对其引起多效性的机理仍不完全清楚。本文采用Western Blot结合图像处理分析方法，观察bFGF对血管内皮细胞β₁整合素表<