［摘要］目的:研究左旋多巴(L-dopa)对大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤(PC12)细胞的凋亡诱导作用并探讨其临床意义。方法:以PC12细胞为多巴胺(DA)神经元的细胞模型，利用电镜、DNA凝胶电泳结合图象分析仪、流式细胞术(FCM)等技术检测不同浓度L-dopa所致的凋亡率以及抗氧化剂谷胱甘肽(GSH)对它的影响。结果:流式术测得50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L处理组凋亡率分别为12.4％、24.4％、37.2％，与琼脂糖电泳的片断化DNA比例基本一致，与对照组（2.3％）有显著差异(P＜0.01)，L-dopa与GSH合用组凋亡率2.5%与对照组比较无显著差异(P＞0.05)。结论:GSH可以阻断L-dopa 对PC12细胞的凋亡诱导作用，提示L-dopa 可能是通过氧化损害介导DA神经元凋亡，导致疗效减退。

［中图分类号］Q279［文献标识码］A

［文章编号］1000-4718(2000)05-0462-04

L-dopa induction of pheochromocytoma12 cells apoptosis and the protective function of glutathione

HAN Yan, CHEN Jun-pao, WANG Luo-wei, YANG Yu-qing, CHEN Pei-yuan

(Department of Neurology, The 456th Hospital of PLA, Jinan 250031， China)

［Abstract］AIM:To study the induction of apoptosis of pheochromocytoma (PC12) cell by L-dopa and the clinical significance.METHODS:Using PC12 cells as the model of dopaminergic neurons, in addition to electron microscopy， agarose gel electrophoresis and flow cytometry, the apoptosis ratio by L-dopa and the effect of antioxidant glutathione on PC12 cells were observed.RESULTS:Treatment of PC12 cells with L-dopa in concentrations of 50 μmol/L，100 μmol/L and 150 μmol/L respectively for 24 hours, results revealed that the apoptosis ratio was 12.8%， 24.4%， 37.2%， respectively, which is in cordant with fragment propartions of agarose gel electrophoresis, more higher than that of control(2.3%)(P＜0.01).The apoptosis ratio of glutathione+L-dopa group was similar to that of control(P＞0.05).CONCLUTION:Induction of apoptosis by L-dopa could be inhibited by glutathione, and oxidative damage may be involved in the pathophysiology of dopaminergic neurons death after long-term treatment of L-dopa.

［MeSH］Levodopa; Cell line; Glutathione；PC12 cells

左旋多巴(L-dopa)及其复方制剂是治疗帕金森病(Parkinsom's disease, PD)最常用且最有效缓解症状的药物，但其疗效一般在2～4年后就会逐渐减退。L-dopa治疗PD疗效减退的机制即其毒性机理不很清楚，早期大量实验已证实L-dopa对体外培养的多巴胺神经元有毒性作用^［1］；后来在体动物实验发现L-dopa对预先给予6-OHDA处理的大鼠黑质多巴胺神经元有毒性作用^［2］；近期发现对于预先用线粒体复合物Ⅰ抑制剂鱼藤酮处理后的中脑神经元，低剂量L-dopa 就可以造成多巴胺神经元死亡，而对其它神经元的损害作用不明显，这种损害可以被抗氧化剂所阻断^［3］。虽然目前仍缺乏L-dopa在体内对黑质多巴胺神经元有毒性作用的证据^［4］，但已明确氧化应激参与了PD病人多巴胺神经元变性，包括黑质神经元脂质过氧化、DNA的氧化损伤（8-羟鸟嘌呤增多）和蛋白质羰基氧化^［5］。我们通过观察L-dopa对大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤(pheochromocytoma，PC12)细胞的凋亡诱导作用及抗氧化剂谷胱甘肽对这一过程的影响，为进一步探讨L-dopa治疗PD疗效减退的机制提供新的思路。PC12细胞具有神经分泌细胞和神经元的性质，已广泛用于神经毒理、神经生化等方面的研究，而且PC12细胞在含有的酶类、膜受体及合成的递质等方面很接近于中脑多巴胺神经元^［6］，因此我们选PC12细胞作为多巴胺神经元的细胞模型。

材料和方法

一、实验仪器及试剂

EPICS ELITE 型流式细胞仪（美国Coulter公司），JEM-1200型电镜（日本JEOL公司）。谷胱甘肽（glutathione, GSH）、左旋多巴、核糖核酸酶（ribonuclease, RNase）、蛋白酶K(Sigma公司)，DMEM、马血清(GIBCO公司)，其余试剂为国产分析纯。

二、细胞培养及药物处理

PC12细胞（中科院上海细胞所）置于DMEM培养液中，内含10％马血清，5％胎牛血清。于对数生长期加入L-dopa处理，使其终浓度分别为50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L，对照组加入DMEM液，另设150 μmol/L L-dopa加1.0 mmol/L GSH组。每个浓度组及对照组各8瓶，24 h后收集细胞。

三、透射电镜观察L-dopa处理的PC12细胞

细胞培养及药物处理同前，用琼脂糖预包埋法制样，常规固定，制作超薄切片，透射电镜观察、摄片。

四、DNA琼脂糖凝胶电泳

细胞培养和药物处理方法同前，24 h后收集细胞按常规方法提取DNA，走1.8％琼脂糖电泳。电泳后凝胶用计算机图像分析系统（computer documentation analysis system, CDAS）和GelBase/GeIBIot软件（UVP ImageStore 7 500, 英国）做定量分析，所得结果为DNA被RNase分解成180～200 bp的整数倍的寡聚核苷酸片段占所有DNA的百分率。

五、流式细胞术检测凋亡率

细胞培养及药物处理同前，24 h后收集细胞，PBS洗2遍，70％冷乙醇固定，PBS重悬制备单细胞悬液，加入RNase至终浓度50 μg/mL, PI(100 μg/mL)染色30 min, 流式细胞仪采集数据。

六、统计方法

所有实验数据以均数±标准差（±s）表示，两组间比较用两组均数的t检验。

结果

一、透射电镜观察细胞形态学改变

单用L-dopa处理组细胞有的胞浆中溶酶体增多，线粒体增生，此时胞核固缩不明显，为早期凋亡细胞，见图1；有的胞核固缩成均质状，胞浆浓缩，胞质中出现大量空泡，溶酶体消失，剩下很多颗粒状残余物，为晚期凋亡细胞，见图2。

Fig 1The earlier apoptosis cell, lysosomes and mitochondria increased ,chromatin condense slightly (×8 000)

1早期凋亡细胞，溶酶体、线粒体增生,胞核固缩不明显

Fig 2The later apoptosis cell, the cytoplasm concentrated and

vacuolized, chromatin condense sharply (×8 000)

2晚期凋亡细胞，胞浆浓缩，出现空泡,胞核固缩成均质状

二、DNA 琼脂糖电泳结果

实验结果显示对照组、L-dopa与GSH合用组未出现DNA条带，50 μmol/L组开始出现少量条带，100 μmol/L组条带增多，而150 μmol/L组则呈现典型的梯状，见图3。

Fig 3The results from different concentrations of

L-dopa by agarose gel electrophoresis

1:control;2:GSH+L-dopa;3:50μmol/L L-dopa;

4:100 μmol/L L-dopa;5.150 μmol/L L-dopa; 6:DNA mark

3不同浓度L-dopa处理组DNA凝胶电泳结果

三、DNA 降解的定量分析

CDAS分析DNA琼脂糖凝胶电泳结果显示，对照组、L-dopa与GSH合用组、50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L各浓度组细胞DNA片段化比例分别为2.5%、2.7%、13.3%、25.7%、39.8%。

四、流式细胞术检测凋亡率

凋亡细胞DNA断裂形成不同大小寡聚核苷酸片段，在FCM的DNA图上表现为G1峰前形成特征性亚二倍体峰（Ap峰），根据该峰所占比例，可进行凋亡定量分析^［7］。50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L处理组的凋亡率较对照组显著增高（P＜0.01），呈明显的量效关系；L-dopa与GSH合用组的凋亡率与对照组比较，差异无显著（P＞0.05）。见表1。

表1不同浓度L-dopa处理组的细胞凋亡百分率

Tab 1Comparison of apoptosis ratios between different concentration L-dopa t