［摘要］目的：检测本实验室构建的表达人细胞色素P450 3A4同功酶转基因细胞系CHL-3A4的硝苯吡啶氧化酶活性。方法：利用多药耐药细胞K562r的阿霉素(ADR)耐药性可被硝苯吡啶逆转，而硝苯吡啶又可特异地被CYP3A4代谢，观察硝苯吡啶在CHL-3A4 S9混合物 (S9 mix) 中孵育前后的生物学活性变化来判断CHL-3A4细胞的CYP3A4硝苯吡啶氧化酶活性。结果：K562r细胞在含有硝苯吡啶(NIF) (12.5 μg·L^-1)的培养基中培养时，对阿霉素的IC₅₀值从不含NIF时的(6.47±0.60) mg·L^-1降至(0.89±0.15) mg·L^-1（P＜0.01）。K562r细胞在含有分别经CHL-3A4、CHL细胞的S9组分和灭活的CHL-3A4细胞的S9组分预处理的NIF(12.5 μg·L^-1)的培养基中培养时，阿霉素对其的IC₅₀值分别为(6.10±0.50) mg·L^-1、(0.32±0.09) mg·L^-1和(0.32±0.04) mg·L^-1。前者和后两者相比P＜0.01。 结论：实验室构建的表达人细胞色素P450 3A4同功酶转基因细胞系CHL-3A4具有硝苯吡啶氧化酶活性，从而进一步确证其表达产物为人CYP3A4同功酶。并为今后检测CYP同功酶活性提供了一种新的途径。

［中图分类号］Q754［文献标识码］A

［文章编号］1000-4718(2000)05-0385-04

Nifedipine induced reversal of multidrug resistance can be deteriorated by S9 mix prepared from the transgenic cell line CHL-3A4

QIAN Yu-li, ZHU Ge-jian, YU Ying-nian

(Department of Pathophysiology and Provincial Laboratory of Medical Molecular Biology, Zhejiang Medical University, Hangzhou 310031, China)

［Abstract］AIM：To demonstrate the expression of human cytochrome P450 3A4 isozyme in the transgenic cell line CHL-3A4 established in this laboratory.METHODS：Nifedipine (NIF) can induce the reversal of the drug resistance for adriamycin of multidrug resistant(MDR) cell K562r. The NIF is the specific substrate for CYP3A4. To determine the NIF oxidase activity of the transgenic CHL-3A4 cells by comparing the biological effect of NIF, which preincubated with or without CHL-3A4 S9 mix. RESULTS：When the multidrug resistance cell K562r was cultured in medium with NIF (12.5 μg·L^-1), a calcium channel blocker and specific substrate for CYP3A, it's IC₅₀ for adriamycin declined from(6.47±0.60) mg·L^-1 to （0.89±0.15) mg·L^-1. When cells were cultured in NIF(exactly the same concentration) pretreated with CHL-3A4 S9 mix , no reversal of MDR was observed ［IC₅₀ for adriamycin is (6.10±0.50) mg·L^-1］ while if NIF was pretreated with CHL S9 or inactivated CHL-3A4 S9 mix, its biological effect was not deteriorated ［IC₅₀ for adriamycin is (0.32±0.09) and (0.32±0.04) mg·L^-1, P＜0.01 respectively］.CONCLUSION：The transgenic cell line CHL-3A4 established in this laboratory have NIF oxidase activity. A new route for detecting the activity of CYP isozyme has been found.

［MeSH］ Cytochrome P-450; Nifedipine; Doxorubicin

转基因细胞系CHL-3A4系本实验室建立的表达人细胞色素P450 3A4（CYP3A4)的CHL细胞系。所转染的表达质粒pREP9-3A4经过酶切图谱分析及插入片段的部分序列分析，证明插入片段为人CYP 3A4 cDNA。双核微核试验也证明此细胞系能代谢活化黄曲霉毒素B1，环磷酰胺和杂色霉菌毒素^［1］，证明其表达产物符合人CYP3A4同功酶特征。但上述底物皆非CYP3A同功酶的特异性底物。因此尚不能确定我室建立的细胞系确实表达了人细胞色素P450 3A(cytochrome P450 3A)同功酶。

已证明钙通道阻滞剂硝苯吡啶(nifedipine，NIF)为CYP3A的特异性底物，文献中曾用高效液相色谱直接测定其代谢产物以检测其酶活性^［2］。本实验设计了一种生物测定(bioassay)方法鉴定CHL-3A4 细胞是否确能代谢CYP3A的特异性底物硝苯吡啶，即利用多药耐药细胞K562r的阿霉素(adriamycin, ADR)耐药性可被硝苯吡啶逆转，而硝苯吡啶又可特异地被CYP3A4代谢，观察硝苯吡啶在CHL-3A4 S9混合物 (S9 mix) 中孵育前后的生物学活性变化来判断CHL-3A4细胞的CYP3A4硝苯吡啶氧化酶活性。

材料和方法

一、细胞系

K562为从红白血病细胞建立的细胞系，K562r为多药耐药细胞系。 CHL细胞为本实验室传代，CHL-3A4细胞为本实验室构建的重组有pREP9-3A4质粒的CHL细胞，重组质粒图见图1。

Fig 1Map of pREP9-3A4 plasmid

1 pREP9-3A4质粒图

二、试剂与培养基

ADR为汕头明治医药有限公司生产；NIF为美国Sigma 公司产品(NIF贮存液以DMSO溶解，浓度为10 mg*L^-1，-20 ℃避光保存)；MEM培养基, RPMI-1640培养基,小牛血清, G418, 胰蛋白酶为Gibco公司产品; 牛血清白蛋白为华美公司产品；NADPH为Fluka公司产品。

三、细胞药敏试验

K562, K562r细胞培养于RPMI-1640 培养基，37 ℃，5% CO₂取对数生长期细胞3×10⁴个细胞接种于96孔培养板内，其中K562为3个复孔，K562r为6个复孔，在每孔中加入ADR，使ADR终浓度分别为50，25，12.5，6.25，3.125，1.56，0.78 mg·L^-1，对照组为0 mg·L^-1,反应总体积均为200 μL， 37 ℃，5% CO₂ 培养72 h后，计数各孔活细胞，并计算ADR的半数抑制浓度IC₅₀^［3］。

四、K562r细胞ADR耐药的NIF逆转试验

在上面所述的培养系统中再加入终浓度分别为500，100，50，25，12.5，6.25 μg·L^-1的NIF，对照组为0 μg·L^-1，每个浓度3个复孔，反应总体积仍为200 μL。培养72 h后,计数活细胞，计算ADR的IC₅₀，并确定能明显逆转细胞耐药性的最低NIF有效浓度。 在观察经S9代谢后的NIF是否影响其耐药逆转作用时，在上面所述的培养系统中分别加入经CHL-3A4 S9, CHL S9, 及灭活CHL-3A4 S9作用过的NIF代谢产物10 μL作耐药逆转试验。

五、细胞S9组分(S9)的制备和硝苯吡啶代谢反应体系

按文献^［4］进行。将在MEM培养基中呈汇合生长的CHL和CHL-3A4细胞以PBS洗涤两次，刮下10瓶细胞用2 mL 0.15 mol·L^-1 KCl混悬，在冰上用超声波粉碎细胞5次，每次2 s，所得匀浆在4 ℃以9 000×g离心20 min，吸出上清液，按Lowry氏法^［5］测定蛋白质浓度，贮于-70 ℃。灭活的S9 以S9在沸水浴中加热15 min获得。并将所有制备的S9的蛋白浓度调整为500 mg·L^-1。

根据本室改进的方法^［6］，反应总体积为1 mL，含S9混合物［KPB（pH 7.4）0.1 mol·L^-1; NADPH 0.2 mmol·L^-1; 0.4 mg牛血清白蛋白（BSA）; S9 200 μL］及底物 NIF 0.25 mg·L^-1, 置37 ℃水浴30 min，过滤除菌。

六、统计处理

用t检验比较结果中两组IC₅₀均数间的差异, 用方差分析比较3组IC₅₀均数间的差异。

结果

一、NIF逆转K562r的ADR耐药性的最低有效浓度为12.5 μg·L^-1, 浓度大于12.5 μg·L^-1时均可逆转，浓度小于6.25 μg·L^-1时逆转不明显，见图2。

Fig 2IC₅₀ of ADR for K562r cells treated with different concentration NIF

2阿霉素（ADR）对经不同浓度的硝苯吡啶（NIF）处理后的K562r细胞的半数致死量（IC₅₀）

二、K562的ADR耐药性和硝苯吡啶逆转K562r的ADR耐药性

K562的ADR IC₅₀为(8.49±3.16) μg·L^-1，K562r细胞的ADR IC₅₀为(6.47±0.6) mg·L^-1，加入12.5 μg·L^-1 NIF后K562r细胞的ADR IC₅₀为(0.89±0.15) mg·L^-1,前两组之间相比P＜0.01，n=3。后两组之间相比P＜0.01，n=3，(图3)。

Fig 3Deter