［摘要］目的：为探讨血小板源生长因子（platelet-derived growth factor,PDGF）受体信号转导途径的介质分子之一过氧化氢（ H₂O₂ ）在低氧的肺动脉平滑肌细胞（pulmonary artery smooth muscle cell,PASMC ）增殖中是否起作用。方法：应用共聚焦显微镜、细胞免疫组织化学及Western印迹杂交等方法，检测了低氧的PASMC PDGF受体途径中的H₂O₂的变化及PDGF和H₂O₂对细胞核内与增殖作用相关的核转录因子NF-κB表达量的影响。结果：PDGF可使常氧的PASMC中H₂O₂浓度增高，但明显降低低氧的PASMC中H₂O₂的量；同一浓度的H₂O₂，作用于常氧的PASMC，则引起核NF-κB的表达量增加，但对低氧的PASMC核NF-κB有明显的抑制作用；同时加入PDGF和H₂O₂的低氧的PASMC较仅以H₂O₂作用的低氧的PASMC，核NF-κB的量显著增加。结论：PDGF受体的信号转导途径在低氧的PASMC同常氧的PASMC相反，H₂O₂为抑制因子，对细胞可能产生损伤作用，PDGF可抑制低氧的PASMC产生H₂O₂并达到促进NF-κB表达增强的目的，从而使胞内与增殖相关的基因表达增强，最终达到低氧条件下表达增强的PDGF对低氧性PASMC过度增殖的正反馈调节作用。

［中图分类号］Q786［文献标识码］A

［文章编号］1000-4718(2000)05-0428-04

Platelet-derived growth factor stimulate the increase of NF-κB expression in the nuclei of hypoxic bovine pulmonary artery smooth muscle cells

HUANG Qun-hua, SUN Ren-yu

(Institute of Basic Medical Sciences, CAMS&PUMC, Beijing 100005, China)

［Abstract］AIM: To reveal whether H₂O₂, a kind of platelet-derived growth factor (PDGF) signaling molecule, involved in the proliferation of hypoxic pulmonary artery smooth muscle cells(PASMCs) and expression of transcription factor NF-κB.METHODS: Laser confocal scanning microscopy, immunocytochemistry and Western blot analysis were used.RESULTS: PDGF (30 ng/mL) elevated the intracellular H₂O₂ in normoxic pASMCs, but decreased that of hypoxic PASMCs significantly. When 100μmol/L H₂O₂ was added, NF-κB expression were inhibited markedly in hypoxic PASMCs, while the same concentration H₂O₂ resulted in increase of NF-κB expression in control cells. CONCLUSION: H₂O₂, a mediator molecule of PDGF signal transduction, act as an inhibitor in hypoxic PASMCs which is quiet different from that in normoxic PASMCs.It may effect on the expression of transcription factor NF-κB. NF-κB induce various gene expression that involving in the proliferation of vascular smooth muscle cells. One mechanism by which PDGF-induced hypoxic PASMC proliferation might be through PDGF alleviating H₂O₂ inhibition.

［MeSH］Platelet-derived growth factor; Hydrogen peroxide; NF-kappa B; Pulmonary artery; Muscle， smooth

H₂O₂为血管平滑肌细胞血小板源生长因子（PDGF）受体信号转导途径中的介质之一，且特异性地增强血管平滑肌细胞DNA的合成，促进细胞增殖^［1～2］。我们以往的实验结果显示，低氧性肺血管平滑肌细胞增殖作用与PDGF及其受体的表达增强有关^［3］，未见报道H₂O₂是否参与此作用。本实验通过观察PDGF对低氧的肺动脉平滑肌细胞H₂O₂的影响以及PDGF和H₂O₂两者对核转录因子NF-κB表达的影响，进一步明确了受体途径中的有关作用环节。

材料和方法

一、肺动脉平滑肌细胞（PASMC）贴块法培养及传代

新生乳牛（北郊农场）开胸后，无菌取肺外肺动脉，洗净，浸入D-Hanks 液中，冰浴带回实验室。在超净工作台内，将肺动脉置于平皿中，剪开血管腔，轻刮去内膜面的内皮细胞，并平行划开内膜面浅层，用小手术镊撕下内膜平滑肌层，按贴块法进行细胞原代培养。培养液为含10％胎牛血清的DMEM。待8～10 d后，观察到组织块周缘滋长出的PASMC已铺满组织块周围，用0.25％胰酶消化传代。实验用3～6代细胞。

二、细胞低氧模型的复制

采用自制的缺氧小室复制低氧模型。12 h低氧组细胞（H）置于缺氧小室中。可通过气体流量控制阀将此小室内的气体氧分压调置在一个恒定水平。向小室内通入10倍容积的95％ N₂-5％CO₂混合气，3min后置换出小室内的空气，再以0.5L/min继续通入混合气，于密闭状态下取培养瓶内的培养液，血液气体分析仪的血气分析结果表明3h后培养液中的氧分压达6.67kPa，控制混合气通入量，使培养液中的氧分压维持在6.67kPa 左右。常氧对照组（N）仍置于5%CO₂-95%空气的细胞培养箱中。

三、PASMC H₂O₂的检测^［4］

分组：N＋30 ng/mL PDGF^［5］，N＋100 U/mL过氧化氢酶^［1］＋30 ng/mL PDGF，H＋30 ng/mL PDGF，H＋100 U/mL过氧化氢酶＋30 ng/mL PDGF。注：N为常氧、H为低氧12 h处理，下同。

将PASMC接种于3.5 mm的细胞培养皿中，待贴壁细胞长势良好时，复制低氧细胞模型。倾去培养液，用HBSS液(不含酚红，下同)稍加冲洗后，每皿加1 mmol/L二氯荧光素（DCF，一种可被H₂O₂氧化的荧光染料，用HBSS稀释）1 mL，37℃，染色30 min。HBSS液洗去未结合的DCF染液，并每皿中加入1 mL HBSS，于共聚焦显微镜下，观察N组和H组以及以100 U/mL过氧化氢酶预孵育的N组和H组共4组细胞分别加30 ng/mL PDGF后荧光强度的变化，以反应PASMC H₂O₂的变化。

四、NF-κB的细胞免疫组化分析（分组：N、N＋100μmol/L H₂O₂^［4］、H、H＋100μmol/L H₂O₂）

PASMC接种于35mm培养皿中，10％血清DMEM培养72 h，PBS过洗后用PBS配制的1%多聚甲醛（pH 7.0），室温固定30 min。再以PBS配制的0.1% Triton-100(pH 7.0)，室温固定5 min。PBS洗两次后，加3％H₂O₂ 处理5 min以消除内源性过氧化物酶的活性。蒸馏水冲洗及PBS浸泡后，经10%正常羊血清室温封闭10 min，再用1∶50稀释的抗NF-κB(P65)抗体(中山公司)，4℃过夜。一抗作用完成后，滴加生物素标记的二抗，37℃孵育30min。用PBS洗去未结合的二抗，加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素，37℃孵育30min。PBS 稍加冲洗后，DAB显色剂显色，封片，照相。

五、Western印迹法检测PASMC核NF-κB的表达（分组：N、N＋100μmol/L H₂O₂、H、H＋100μmol/L H₂O₂）

(一)样品收集（即PASMC核抽提物制备）^［6］细胞培养至10⁸个，分组低氧实验结束后，室温下用PBS清洗培养瓶中贴壁生长的PASMC以清除培养基。胰酶消化，1200 r/min离心5 min，再用PBS洗涤细胞两次×5 min，均2000 r/min离心收集细胞。以下步骤在冰上进行。将细胞悬浮于5倍体积Buffer A中，冰浴中溶胀15 min，2000 r/min离心收集细胞，再将细胞悬浮于2倍体积Buffer A中，用玻璃匀浆器将细胞匀浆至90％破裂，随时以台盼兰染细胞，镜下观察破膜效果。4℃，4000 r/min离心10 min，去上清。重复离心一次，去上清。重悬沉淀于1 mL Buffer C中，用玻璃匀浆器匀浆10次左右，于冰上轻柔搅拌30 min进行核抽提。4℃，15 500 r/min离心30 min后收集上清，于低温条件下用Buffer D透析3 h。经4℃，15 500 r/min离心20 min，收集上清并分装，保存于-70℃备用。［Buffer A：含mmol/L*HEPES(pH7.9) 10， KCl 10， EDTA(pH8.0) 0.2， *PMSF 0.5， *DTT 0.5和25%甘油（v/v）；Buffer C：含mmol/L *HEPES(pH7.9) 20，MgCl₂ 420，EDTA(pH8.0) 0.2， *PMSF 0.5，*DTT 0.5和25% 甘油（v/v）；Buffer D：含mmol/L *HEPES(pH7.9) 20，KCl 0.1， EDTA(pH8.0) 0.2， *PMSF 0.5，*DTT 0.5和20% 甘油（v/v）。注意带*使用前加入］。

(二)SDS-PAGE电泳核抽提物经蛋白定量，等体积的2×电泳加样缓冲液混合后，煮沸5 min,于每泳道上样20μg。根据蛋白质分子量的大小，用于检测核P65的聚丙烯酰胺分离胶的浓度为10％。标准方法走电泳。电转：按电转仪使用说明将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，为观察蛋白质转移情况并对蛋白质分子量标准参照物进行定位，对滤膜进行丽春红染色，观察完毕用去离子水漂洗净染液再进行免疫染色。

(三)免疫显色反应10<