［摘要］目的：用胚胎干细胞(ESC)体外诱导分化为心肌细胞，从分子水平上研究早期心脏发育相关基因及其功能。方法：(1)胚胎干细胞的培养。(2)胚胎干细胞的分化培养。(3)被分化的心肌细胞鉴定：RNA的提取；心脏特异性引物的合成和RT-PCR反应；探针标记、纯化和比放射活性测定；RNA斑点杂交。结果：用最适条件培养液对ESC定向诱导分化，可使80%以上的ESC分化为心肌细胞。心肌细胞以同步的方式进行收缩。反转录PCR和斑点杂交的结果显示：心肌在早期发育就开始表达其特异性基因。结论：胚胎干细胞体外能诱导分化为心肌细胞。胎牛血清、二甲基亚砜和维甲酸的浓度及它们之间的组成不同，对ES细胞定向诱导为心肌细胞均有影响。最佳诱导条件是用2 nmol/L维甲酸、0.6%二甲基亚砜和20%胎牛血清组成的条件培养液。

［中图分类号］Q254［文献标识码］A

［文章编号］1000-4718(2000)05-0389-04

A study of inductive factors of embryonic stem cells differentiating into cardiac myocytes in vitro

LIU Lan-ying，YANG Kun，ZHU Zheng-yu, LIU Yu-chuan，YIN Wei¹, MA Jian-quan, GU Jun

(The Recearch Cernter of Molecular Medicine, SUN Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510089, China)

TANG Jian

(Cardiovascular Basic Institute, Beijing University of Medical Sciences, Beijing 100089, China)

YU Xi-yong

( Cardiovascular Institute, Guangdong Provincial People Hospital, Guangzhou 510080, China)

［Abstract］AIM: To study cellular and molecular mechanisms of cardiac development associated genes expression and its function during early stage cardiomyogenesis.METHODS: (1) Mouse embryonic stem cells (ESC) line D3 culture.(2) Inductive culture of ESC differentiated into cardiac myocytes in vitro. (3) Identification of ESC-derived cardiac myocytes: RNA isolation; synthesis of specific primer and RT-PCR; Label of RT-PCR products with ［α-³²P］ dATP as probes, purifyed by sephadex G-50 columns, determined the yield of DNA. RNA dot hybridization.RESULTS: 80% of ESC differentiated into cardiomyocytes by improved conditional medium. Cardiomyocytes contracted in a synchronous manner. The results of RT-PCR and RNA blot showed that cardiac genes were expressed abundantly and specifically during the early cardiomyogenesis.CONCLUSIONS: ESC were able to be differentiate into cardiomyocytes. Different concentrations and components of RA, DMSO and FCS affected ESC cardiomyogenesis in vitro. The optimal result obtained was from the conditional medium, a mixturce of 2 nmol/L retinoic acid (RA), 0.6% dimethyl sulfoxide (DMSO) and 20% fetal calf serum (FCS).

［MeSH］Embryonic; Stem cell; Myocardium; Gene expression

鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESC)是高度未分化的多潜能干细胞，能在体外自然分化为内脏卵黄囊、血岛、神经细胞、心肌细胞等^［1］。ESC的建立使体外心肌发生的模型构建成为可能，为后来者研究各种器官的发生、相关基因的转录调控作用及信号传导方面拓宽了领域。90年代初，国外学者开始将ESC分化为心肌细胞，建立了体外心肌发生模型^［2］，使不少学者研究体外心脏形成、早期心脏发育相关基因及其功能机制^［3,4］、先天性心脏病的发病机制和干预性治疗成为可能，但至今为此，ESC分化为心肌细胞的比率并不理想。在国内这方面的研究不多，目前还未见有将ESC诱导分化为心肌细胞的报道。本研究综合前人的方法，探讨最佳ESC诱导分化为心肌细胞的因素。

材料和方法

一、材料

(一)ESC-D3本校病理教研室提供。

(二)昆明鼠本校动物中心提供。

(三)主要试剂DMEM(Dulbeccos modified Eagles medium),TRIZOL试剂、Sephadex G-50购于Gibco公司，β-巯基乙醇购于SERVA公司，反转录PCR试剂盒购于BOEHRINGER MANNHEIM公司，二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO),维甲酸

(retinoic acid, RA),甲酰胺、甲醛、水溶性聚蔗糖、聚乙烯吡咯酮(polyvinylpyrrolidone),鲑鱼精DNA购于Sigma公司，胎牛血清(fetal calf serum,FCS)购于Hyclone公司。

(四)引物：β-actin和β-MHC.β-actin引物其上游序列为5′-GGGTCAGAAGGATTCCTATG-3′，下游序列为5′-GGTCTCAAACATGATCTGGG-3′;β-MHC引物其上游序列为5′-ATCAAGGAGCTCACCTACCAG-3′，下游序列为5′-TCGACAATGTGTCCGAGGTC-3′，均由Gibco公司合成。

二、方法

(一)ESC-D3的培养^［5］ESC需在鼠胚饲养层上生长才能保持未分化特性。饲养层是用13～15 d的鼠胚成纤维细胞制成，并用10 μg/mL的丝裂霉素处理1.5 h。ESC所用的培养液(medium)为高糖的DMEM，其内含有0.1 mmol/L β-巯基乙醇、10%的小牛血清和10%胎牛血清(FCS)。每隔2 d换1次培养液和1次饲养层。

(二)条件培养液的制备和ESC诱导分化培养^［6～8］

1.条件培养液的制备按RA、DMSO和FCS浓度不同分为3部分，每1部分以其中1种浓度变化而其它两种不变分为10个组，每组按下列不同浓度和组成进行：(0～0.9)%DMSO、0～9 nmol/L维甲酸、和(10～28)%FCS溶于含有0.1 mmol/L β-巯基乙醇、pH 7.4的DMEM溶液中。

2.ESC悬浮培养ESC在除去饲养层的条件培养液中进行诱导分化。将ESC制成悬滴(每个悬滴含200～400个ESC)置平皿盖内面(底面平皿内含有少量PBS溶液)进行培养，两天后形成细胞集落称为胚胎体(embryoid bodies, EBs)，将EBs转入直径是100 mm平皿内悬浮培养5 d(共7 d)。每组制备30个悬滴。

3.EBs贴壁培养首先用明胶处理盖玻片，然后置入24孔板中，再把每个EBs分别放在各个孔里的盖玻片上，加少量培养液于37℃温育4～5 h，以便EBs贴壁。贴壁后加适量培养液(每3 d换1次)，此时“7+0 d”开始用倒置显微镜(25～100倍)每日进行观察，以捕获心肌开始跳动的最初时间及连接收缩的总时间。

(三)心肌细胞RNA的提取收集不同收缩时间的心肌细胞，分别提取总RNA。1×10⁷心肌细胞加1 mL TRIZOL充分混匀，加0.2 mL的氯仿混匀、离心、取上清，加等体积的异丙醇混匀、离心，沉淀用75%的乙醇洗涤。具体过程参照TRIZOL Reagent说明书。

(四)引物设计和反转录PCR设计β-actin引物和心脏特异性β-MHC引物，用它们分别对不同时间分化而来的心肌细胞RNA进行反转录PCR。0.2 mL薄壁管中加下列主要试剂：0.2 mmol/L的脱氧三磷酸核苷(dNTP)混合物，5 U RNA抑制剂，分别加4 μmol/L上下游引物，1 μg RNA模板，1 μL酶混合物等总体积50μL于55℃温育40 min,95℃变性4 min，然后94℃ 30 s,58℃30 s，68℃90 s，35个循环。具体过程参照Titan^TM one tube RT-PCR kit说明书。

(五)探针的标记、纯化和比放射活性测定反转录PCR产物在DNA聚合酶1 Klenow大片段作用下，用［α-³²P］dATP标记为探针，sephadex G-50层析柱纯化，三氯乙酸(trichloroacetic acid, TCA)沉淀法测其比放射活性。具体过程参照Sambrook等^［9］的方法。

(六)RNA斑点杂交收集未分化的ESC和分化不同收缩时间的心肌细胞，分别提取其总RNA，用BioRad真空抽吸仪将RNA点到Bio dyNEB尼龙膜上，室温凉干，80℃烘干1 h。用上述探针分别与含有样本RNA的尼龙膜进行杂交，杂交液含有甲酰胺、水溶性聚蔗糖、聚乙烯吡咯酮等，预杂交于42℃杂交2 h，杂交时加入探针于42℃杂交16 h。然后进行洗膜和放射性自显影^［10］。

结果

一、不同浓度的RA、DMSO和FCS对ESC向心肌细胞分化的影响

ESC是高度未分化的具有典型形态的多潜能干细胞(图1)。在实验过程中，设计不同条件培养液，分析它们对ESC定向分化的影响。按RA、DMSO和FCS浓度不同分为3部分，第一部分RA浓度不同(0～9 nmol/L)而DMSO(0.6%)和FCS(20%)不变分为10个组，第二部分DMSO浓度不同(0～0.9%)而RA(2 nmol/L)和FCS(20%)不变分为10个组，第三部分FCS浓度不同(10%～28%，每组相隔2%)而RA(2 nmol/L)和DMSO(0.6%)不变分为10个组。每组结果均来自于30个悬滴中分化为心肌细胞的胚胎体平均百分数(embryoid bodies with beating cardiac myocytes %)。图2显示上述3部分结果。从图可见，第一部分的第1组未加RA，仅加了0.6% DMSO和20%的FCS，分化效率为67%，影响不明显；第二部分的第1组未加DMSO，仅加了2 nmol/L RA和20%的