［摘要］目的：观察膜环境高温对下丘脑神经元延迟整流性K^＋通道(I_K)电压依赖性的影响。方法：采用细胞贴附式的膜片钳技术。结果：高温可影响通道的电压依赖性，使电压依赖曲线发生正向移位，过高温度则使电压依赖性减弱甚或丧失。结论：I_K电压依赖性的变化可能参与机体的发热和中暑发病过程。

［中图分类号］R594.1［文献标识码］A

［文章编号］ 1000-4718(2000)05-0440-03

Effect of membrane environment at high temperature on voltage-dependence of delayed rectifier K^＋ channel in hypothalamus neurons

CAI Chun-qing, ZOU Fei, ZHU Shou-cheng

(Department of Thermal Environmental Medicine, the First Military Medical University, Guangzhou 510515,China)

［Abstract］AIM：To observe the effects of high temperature on voltage-dependence of delayed rectifier K^＋ channel (I_k) in hypothalamus neurons.METHODS:The date recording from cell-attached patches of patch-clamp technique.RESULTS:With temperature raising, shift of voltage dependence may be mediated at different degree, while higher temperature might weaken and depressed.CONCLUSION:Shift of voltage dependence likely contributed to the body fever and heatstroke.

［MeSH］Temperature; Potassium channels; Hypothalamus; Neurons

下丘脑神经元参与体温调节，有较强的温度敏感性^［1］，由于膜的兴奋性与K^＋通道有关，K^＋通道的电压依赖性能够影响神经元动作电位的时相，为此观察热应激和热损伤温度对下丘脑神经元延迟整流性钾通道(I_K)电压依赖性的影响，为揭示机体发热和中暑的机制提供一些线索。

材料和方法

一、新生大鼠下丘脑神经元的急性分离

取5～10 d SD大鼠，断头取脑，在解剖显微镜下分离出下丘脑，放入盛有常温人工脑脊液的离心管中，其成份(mmol/L)为：NaCl 140，KCl 5，NaHCO_３ 20，NaH_２PO_４ 1，CaCl_２ 2，MgSO_４ 2，葡萄糖 10， pH 7.4，通O_２平衡30 min后移放入新配置的2.5%胰蛋白酶-人工脑脊液3 mL中，消化15 min取出，用针头划成丝状，加入2 mL DMEM液吸入离心管中，Pasteur吸管连续吹打，分散游离细胞，取上部悬液加到已涂有0.1%的多聚赖氨酸盖玻片上静置。

二、神经元的温度处理

利用恒温灌流装置对浴槽液进行32℃、37℃、39℃和43℃温度液体的循环灌流，温度误差小于±0.5℃。40 min后对神经元进行单通道记录，浴槽液成份(mmol/L)为：NaCl 140，KCl 5，CaCl_２ 2，MgSO_４ 1，Hepes 10,TTX0.001，CdCl_２0.2(Sigma)，葡萄糖10，pH7.4。

三、单通道记录和资料分析

实验在倒置显微镜下进行，用微电极液压操纵器(NARISIGE)控制电极接近神经元，记录用玻璃微电极阻抗为8～12MΩ，封接阻抗大于5GΩ，电极液成份同浴槽液。采用的记录模式除说明外均为细胞贴附式，使用PCLAMP 6.0.2程序通过Digita 1200(Axon instrument CO.USA)支持的CEZ-2400型膜片钳放大器(NIHON KOHDENO，Japan)对下丘脑神经元单通道电流进行采样、分析和测量，忽略水平300 μs，数据采用方差分析处理，以±s表示。

结果

一、通道电流活动的特性

室温下采用细胞贴附式观察18例神经元活动，将电极电压(Vp)钳制为0mV时，即当Vp等于浴槽液电位，未见通道活动；当Vp为负时，膜去极化，波形显示为向下的外向电流。该电流随去极化程度增大而幅度增高，开放时间延长，表明通道存在电压依赖性(图1)。室温下采用内面向外式，膜片内外对称性地使用120 mmol/L［K^＋］o和［K^＋］i，钳制电位(Vh)为负时观察到内向电流，为正时则出现外向电流，翻转电位(Erev)始终接近于0mV(n=5)，平均单通道电导为(84±17) pS；当［K^＋］o浓度为0时，只观察到外向电流，用相同浓度的Na⁺取代K^＋，电流消失；当［K^＋］o/［K^＋］i为120/50 mmol/L时，Erev为(20±5) mV(n=3)；改变双侧［Cl^］和［Ca^2＋］通道活动未见改变。用120 mmol/L的CsCl_２取代细胞外液中的KCl时，通道电流消失；向浴槽液中加入20 mmol/L的4-AP，通道电流未见改变(n=7，P＞0.05)；加入20 mmol/L的TEA，通道电流变小(P＜0.05)。

Fig 1I_K currents recorded from a cell-attached membrane patch of acutely isolated hypothalamus neurons from SD postnatal rats

1下丘脑神经元膜上的I_Ｋ电流

二、高温对通道电流电压依赖性的影响

(一)开放动力学下丘脑神经元K^＋通道开放时间长短差异悬殊，采用二级指数拟合得到长、短两个时间常数，长时程开放时间常数(τ₀₂)可以较好地反映通道的活动状态。当Vp从-20mV去极化到-60mV，32℃时，在14例膜片上观察到通道的长时程开放时间常数从(17.86±4.37) ms升至(88.28±32.59) ms(P＜0.01)；当温度升至39℃时，τ₀₂从(25.01±6.52) ms升至(142.84±28.17) ms(P＜0.01)，电压依赖曲线向左上方移位。在相同的去极化水平两组相比有显著性差异(P＜0.05)。32℃、37℃和39℃ 3组温度下τ₀₂电压依赖性曲线的斜率分别为17.63、20.30和23.76(图2A)，表明温度升高可使τ₀₂的电压依赖性发生迁移，通道开放时间延长。而当温度进一步升至43℃后，通道的τ₀₂随膜电位的去极化整体上仍表现为增高趋势，但线形相关较差，局部出现不规则变化(图2B)。

(二)开放概率温度升高，开放概率(Po)增加，如图2C所示，在14例膜片中观察到，温度从32℃升至39℃后，当Vp由-20mV去极化到-60mV时，Po分别由0.027±0.011和0.433±0.147(P＜0.05)升至0.217±0.067(P＜0.05)和0.850±0.312(P＜0.05)，可见升高温度和增大去极化水平，两者均可使Po升高，且二者存在协同作用。神经元经43℃处理后，去极化水平增加，Po曲线失去线形增高趋势，表现为不规则的变化(图2D)。

Fig 2Effects of high temperature at 32℃、37℃、39℃(A，C) and 43℃(B，D) on voltage-dependence in open-time and Po of I_K(±s,n=14)

2不同温度对I_K开放时间和开放概率电压依赖性的影响

(三)爆发样开放对通道活动的爆发样(Burst)开放进行分析拟合，发现通道的爆发样开放也具有温度依赖性(图3)，经43℃处理后，爆发样开放在开放时程(图3A)和Po(图3B)方面明显减小(P＜0.05，n=16)。

Fig 3Effects of heat stress and heat injury on burst open open time constant(A) and P_o(B) of I_K(±s，n=16)

3热应激热损伤温度对I_K爆发样开放开放时程和开放概率的影响

讨论

本文记录到的通道对K^＋具有高度的选择通透性，在开放动力学方面具有明显的电压依赖性，结合对K^＋通道阻断剂的反应，提示为I_K。下丘脑神经元I_K在电流幅度、开关时程参数、开放概率等方面具有明显的电压依赖性，这种电压依赖性与分子结构有密切的关系。I_K通道在结构上呈现为四聚体，各功能区中的S_４段虽疏水但富含带正电荷的氨基酸残基^［2］，这些门控电荷在S_４段旋转^［3］时可被邻近S₁和S_２段的负电荷所中和，I_K电压依赖曲线移动的原因与这些电荷被中和有关^［4］。高温可诱发通道电压依赖性的迁移和丧失，曲线表现为向更正的方向移动，一般在温度不超过40℃时出现，Griffin也有类似报道^［5］，温度升高引起膜输入阻抗R(R＝1/g,g为电导)减小