［中图分类号］Q74［文献标识码］A

［文章编号］1000-4718(2000)05-0470-04

Effects of peroxynitrite on the endothelial cells

CHEN Yu, JIN Hui-ming

(Dept. of Pathophysiology, Shanghai Medical University, Shanghai 200032, China)

【A Review】Endothelial cells produce both superoxide and nitric oxide. Nitric oxide and superoxide are known to react rapidly to form the stable peroxynitrite anion. Peroxynitrite mediates the oxidation of protein, lipid, deoxyribose and inhibits mitochondrial electron transport. Peroxynitrite may break DNA strands and activate poly(ADP-ribose) synthetase. If the reaction is excessive, it results in a depletion of intracellular NAD^＋ and ATP. There is ultimately cell death.

［MeSH］Nitrites; Endothelium; Cells; Nitric oxide

一氧化氮(nitric oxide, NO)和O^-₂反应生成过氧亚硝酸盐(ONOO^-)，ONOO^-性质活泼且氧化能力强，对血管内皮细胞有损伤作用。ONOO^-能硝化酪氨酸，对细胞产生广泛的生物效应。ONOO^-与多聚ADP核糖合成酶即 poly (ADP-ribose) synthetase, PARS 相互作用产生一系列的反应，影响细胞功能。本综述针对以上问题进行探讨。

一、ONOO^-的生成和降解^［1～3］

NO是一种气体自由基，具有脂溶性，它是一种多功能的信息分子。内皮细胞在乙酰胆碱、ATP、缓激肽等神经激素及切应力的刺激下，激发受体介导的Ca²⁺内流，使细胞内Ca²⁺水平增加，激活Ca²⁺激活的NADPH依赖酶:一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)，血管内皮细胞中既有组成型NOS(constitutive NOS,cNOS)，又有诱导型NOS(inducible NOS, iNOS)。在上述刺激因素的作用下，NOS通过氧化L-arginine产生NO。血管内皮细胞能产生高于激活鸟苷酰环化酶所需浓度10～40倍的NO，但大部分NO在血管腔中丧失。NO的反应主要是与鸟苷酰环化酶中的亚铁血红素结合，激活cGMP；通过与O^-₂反应生成毒性物质过氧亚硝酸盐ONOO^-；或者可被氧合血红蛋白清除。高浓度NO细胞的长期作用可使cGMP的浓度升高到足够的水平以激活cAMP依赖性酶。mmol/L的NO会可逆性抑制过氧化物酶，也可抑制核糖核苷酸还原酶，核糖核苷酸还原酶是含有酪氨酸残基的合成DNA前体的关键酶，但这过程是可逆的。NO的作用依赖于其所处的微环境及其与超氧阴离子O^-₂、血红蛋白、巯基的相互作用。O^-₂有直接的毒性作用，内皮细胞产生的NO是其作用的重要靶物质。NO是一种在病理状态下能产生足够高的浓度与超氧化物歧化酶竞争O^-₂的生物分子。而高浓度时则有细胞毒作用，并与细胞损伤有关^［1］。以前往往认为NO直接与细胞毒相关，并认为它寿命很短、具有高反应性，实际上，在生理浓度时的NO并不是很活泼，毒性也较体外实验所提示的要低。NO的直接毒性是很弱的，但产生的ONOO^-能增强其毒性^［2］，mmol/L的NO能短暂抑制细胞色素c氧化酶，增加从电子传递链中泄漏出的O^-₂，O^-₂ 与NO反应生成的ONOO^-会不可逆地损伤线粒体。ONOO^-降低NO的生物活性，参与细胞粘附的增强、细胞增殖、血管收缩，加速动脉硬化的损伤。NO与血管内皮细胞释放的超氧阴离子O^-₂ 相作用；生成强氧化剂ONOO^-，其速度很快，NO和O^-₂的反应速率常数(K值)为6.7×10⁹ M·s^-1，3倍于超氧化物歧化酶清除O^-₂ 的速度。NO和O^-₂相遇几乎都能生成ONOO^-。生成ONOO^-的速度与NO生成速度及O^-₂的浓度有关。如两者浓度有较小的增加，ONOO^－的浓度即会高到细胞毒的水平^［3］。ONOO^－在37℃时pKa为6.8，半衰期约为1 s。在生理pH溶液中ONOO^-是一个不稳定的分子，可生成共轭酸─过氧亚硝酸(ONOOH)，NOOO^-一旦质子化则快速降解，ONOO^－可分解产生NO₂·及·OH分子，μmol/L、mmol/L浓度的ONOO^-分解产生羟自由基，有高度的细胞毒作用，引起显著的细胞损伤, ONOO^-可作为NO毒性作用的介导。ONOO^-也可通过分子内重排产生硝酸盐，分解产物与所处的化学环境有关。在碱性pH溶液中它可作为一个离子稳定存在也是其产生毒性作用的基础。

二、ONOO^-的生物学特性^［4～12］

ONOO^-可能参与氧化剂诱导的细胞损伤，血管内皮细胞在许多病理状态下成为损伤的靶目标。病理情况下,激活的内皮细胞能在体内产生ONOO^-, 降低抗氧化剂的作用, 通过各种机制引起组织的氧化损伤及影响信号转导通路^［4，21］，如氧化剂介导的血管内皮细胞损伤导致内皮细胞屏障功能的丧失、血小板粘附和血管调节异常。ONOO^-能与很多生物分子起反应，氧化脱氧核糖、脂质和引起巯基的过氧化，可诱发蛋白质酪氨酸残基的修饰，降低GSH含量，引起DNA损伤，抑制线粒体呼吸功能及乌头酸酶的活性，抑制Na^＋-K^＋-ATP酶活性等。膜脂质经磷脂酶A₂作用后生成的花生四烯酸被ONOO^－氧化，引起细胞膜功能障碍和结构损伤。 ONOO^-也能破坏肺泡Ⅱ型细胞、特殊表面活性剂脱辅基蛋白及毛细血管内皮细胞。ONOO^-氧化表面活性剂蛋白A，使其功能下降，ONOO^-作为一个选择性的氧化剂，被认为有直接的细胞毒作用。其作用机制可能是直接氧化细胞成分, 改变其功能特性或致NO₂产生及介导羟自由基的作用。

ONOO^-在酪氨酸硝基化中的作用ONOO^-在生理性pH条件下，能与蛋白质中的酪氨酸残基或游离的酪氨酸反应^［5］，使酪氨酸硝基化产生硝基酪氨酸，反应不需金属的存在。许多与亚单位相互连接有关的酪氨酸作为未被结合的结构暴露于溶液中，能被与超氧化物歧化酶结合的ONOO^-作用。超氧化物歧化酶能快速地与ONOO^-结合^［6］，更有选择性地催化某些蛋白质中的酪氨酸残基进行硝基化。生物体中存在的大量的ONOO^-的靶物质使与超氧化物歧化酶结合的ONOO^-具有更高的效力。体内140多种蛋白质的活性与酪氨酸残基有关，如经化学诱导硝基化，可抑制其活性；ONOO^-介导的酪氨酸的硝基化可使蛋白质酪氨酸激酶磷酸化合成多肽的能力抑制51％，酪氨酸激酶的硝基化可使其功能进一步恶化。酪氨酸的硝基化可影响酪氨酸的磷酸化与去磷酸化反应，抑制蛋白质的磷酸化，干扰细胞调控和信号转导通路。细胞调节中重要蛋白质的酪氨酸的硝基化可能与许多病理过程有关。血管内皮细胞在ONOO^-的作用下，能进行酪氨酸磷酸化的蛋白质的含量降低，而酪氨酸硝基化的蛋白质的含量则增加。酪氨酸的硝基化可干扰靶蛋白的降解过程^［7］。结构蛋白在体内量多且较稳定，包括神经微丝和肌动蛋白，在一些疾病中细胞骨架蛋白可能发生硝基化，其硝基化严重损害骨架蛋白亚单位组装成正确的结构，与体内的主要的病理过程有关。结构蛋白的酪氨酸硝基化引起各亚基结构的破坏，影响蛋白质的结构和功能，最终危及细胞功能。酪氨酸的硝基化能抑制细胞色素P450，抑制人免疫球蛋白IgG补体亚单位C1q的结合能力。随着硝基酪氨酸的形成，血浆中的抗坏血酸盐也相应地消耗。血管壁内源性蛋白质的硝基化可增强其抗原性，引起炎症细胞粘附到血管壁，从而导致血管损伤。硝基酪氨酸抗体的出现提示在人动脉硬化等疾病中有血管壁组织的硝基化存在^［8］。

ONOO^-激活PARS的联锁反应ONOO^-诱导的细胞损伤作用与多聚ADP核糖合成酶(PARS)有关。PARS是一种染色质结合酶，也是一种核内DNA修复酶, 在DNA链断裂的修复中起着维持基因组完整性的生理作用。生理情况下，PARS被激活后，催化NAD⁺中的ADP核糖部分转移到蛋白质受体,并形成尼克酰胺,结果使NAD⁺含量降低,尼克酰胺产生负反馈作用,抑制PARS活性。在ATP作用下, 尼克酰胺生成NAD⁺。适当的PARS激活有利于维持基因组的完整性,而过度激活则导致细胞死亡^［9，22］。在体外各种细胞中, ONOO^-是 DNA链断裂的有效激活剂，ONOO^－与核糖作用生成8-羟脱氧鸟嘌呤核苷或8-硝基鸟核苷酸，导致核酸戊糖环脱氢，引起DNA单链断裂，断裂的DNA单链过度激活核内酶PARS，消耗细胞内NAD⁺、ATP，引起剂量依赖性线粒体呼吸的抑制^［10］。由于NAD⁺是线粒体电子传递的必需物,其含量下降致ATP合成减少,最终引起细胞能量障碍, 导致不可逆性细胞毒及细胞死亡，严重时甚至导致器官功能衰竭。ONOO^-浓度依赖性激活PARS，暴露于高浓度氧化剂中时，PARS依赖的细胞毒作用占主要优势。但是也有人认为ONOO^-在生理溶液的短半衰期使其不太可能穿透细胞膜，进入核破坏DNA，引发PARS的激活和细胞能源耗竭的级联反<