［摘要］目的：探讨活性氧过氧化氢(H_２O_２)对心肌细胞损伤作用。方法：用不同浓度的H_２O_２作用于新生鼠培养心肌细胞，通过琼脂糖凝胶电泳、Giemsa染色和流式细胞仪等方法观察H_２O_２对心肌细胞的凋亡性损伤作用，同时检测培养介质中乳酸脱氢酶(LDH)和丙二醛(MDA)等生化指标的改变。结果：5 mmol/L H₂O₂作用于培养心肌细胞6 h，在琼脂糖凝胶电泳上出现梯状DNA带；Giemsa染色细胞涂片可见到染色体浓聚或边缘化，成新月型聚集在核膜周边，并有凋亡小体的存在；流式细胞仪可检测出亚二倍体峰的出现。结论：H_２O_２具有浓度和时间依赖关系诱导心肌细胞的凋亡，在低浓度H_２O_２(＜1 mmol/L)导致培养心肌细胞的早期生物化学改变，自由基含量升高，膜通透性增加，同时伴有少量心肌细胞凋亡；而在高浓度H_２O_２(＞10 mmol/L)时会造成培养心肌细胞的坏死性死亡，细胞膜崩塌，脂质过氧化物(MDA)大量产生，LDH大量泄漏，DNA琼脂糖凝胶电泳出现弥散(smear)泳带；5～10 mmol/L H_２O_２诱导大量心肌细胞凋亡性死亡，同时伴有LDH和MDA含量升高等生物化学的改变。

［中图分类号］R363.21［文献标识码］A

［文章编号］1000-4718(2000)05-0457-05

Study on apoptotic and nonapoptotic injuries induced by hydrogen peroxide in cardiac myocytes

CAO Chun-zhang, YANG Shao-juan, BU Li-sha, YANG Tong-shu

(Central Laboratory, Third Clinical Teaching College, Norman Bethune University

of Medical Sciences, Changchun 130031, China)

［Abstract］AIM: To study apoptotic injury induced by reactive oxygen species-hydrogen peroxide (H_２O_２) on cardiac myocytes.METHODS:Cultured rat neonatal cardiac myocytes were treated with H_２O_２ of various concentration to observe apoptotic injury of cardiomyocytes by agarose gel electrophoresis, Giemsa-stained smears of cell, and flow cytometry, meanwhile lactate dehydrogenas (LDH) and malondialdehyde(MDA) were determined to assess the effect of H_２O_２ on lipid peroxidation and permeability of the plasma membrane.RESULTS: 5 mmol/L H_２O₂ caused cultured cardiomyocytes apoptotic morphological characteristics, including nucleosomal DNA fragmentation in myocytes by agarose gel electrophoresis (DNA ladder), cell shrinkage, nuclear condensation, and chromatin margin by Giemsa-stained cell smears, and aneuploid peak(AP)-apoptotic bodies occurrence by flow cytometry.CONCLUSIONS: H_２O_２-induced apoptosis in myocytes was a time-and concentration-dependent process. Treatment with low concentration of H_２O_２(＜1 mmol/L) only caused cardiomyocyted early biochemical changes, such as increase of free radicals level and membrane permeability ,which were pro-apoptotic injurious features. High concentration of H_２O_２ (＞10 mmol/L) rapidly induced a necrotic form of death characterized by smeared patterns of DNA digestion on agarose gel electrophoresis and lethal membrane disruption (as measured by LDH release). Exposure of 5～10 mmol/L H_２O_２ induced cardiomyocytes apoptosis concurrently with biochemical changes of LDH and MDA increase in the medium.

［MeSH］Oxygen; Hydrogen peroxide; Myocardium; Cells, cultured; Cell death

细胞凋亡是真核生物细胞最基本的生命过程之一，通过激活细胞内源性的自杀机制及时清除生理上不需要的、严重受损的和有潜在危险的细胞。细胞凋亡是一个主动的、由基因指导的细胞死亡过程，它与坏死性细胞死亡可从形态学和生物化学上区分开来。最近的研究表明，心脏疾病时如：缺血/再灌注损伤^［1］、心肌梗塞^［2］、心力衰竭^［3］等人或动物的心脏中，都存在心肌细胞凋亡性死亡，细胞凋亡是心肌细胞死亡的一个重要机制，在心脏重塑、心脏功能障碍进一步发展过程中起重要的作用。但是，人们对心肌细胞凋亡的分子机制仍不清楚。

导致细胞凋亡的许多类型的刺激能造成细胞内活性氧的产生，另外将外源性氧化剂作用于细胞也可诱导细胞凋亡^［4］，因此活性氧的产生可能直接参与细胞凋亡过程。过氧化氢(H_２O_２）是体内氧化代谢的中间产物，同时又是一种活性氧。H_２O_２的浓度积累达到一定程度会对心肌细胞产生损伤作用。本研究目的是确定H_２O_２的浓度积累所造成心肌细胞的生物化学改变和细胞形态学所见，以及心肌细胞凋亡产生中，其生物化学改变和细胞凋亡、细胞坏死等细胞形态学所见之间的关系。

材料和方法

一、心肌细胞的培养^［5］

取新生1～2 d的Wistar大鼠的心室肌组织，研碎，用0.25%的胰蛋白酶分别消化5、15、20 min，将后两次的细胞悬液混合在一起。预培养90 min去掉非心肌细胞，以3×10^５细胞/mL的密度置入培养器皿中，在36.5℃的CO_２(5%)孵箱内进行培养。培养基为MEM(含15%小牛血清)。在培养4 d后细胞达融合状态后施加H_２O_２损伤因素，作用一定时间后做检测，以不含H_２O_２的培养心肌细胞作对照。

二、DNA琼脂糖电泳

培养完毕后，将细胞溶解在裂解液中，37℃保温18 h。用酚、氯仿、异戊醇抽提DNA两次，用乙醇-20℃沉淀DNA，过夜。10 000×g离心30 min，沉淀重新溶解在TE中，用100 μg/mL RNase 10μL于37℃保温1 h。再用酚、氯仿、异戊醇抽提DNA，用70%乙醇沉淀DNA。沉淀重新溶解在TE液中，在1.8%琼脂糖凝胶上电泳，用溴化乙锭染色，紫外灯下观察。

三、流式细胞术(flow cytometry)检测心肌细胞凋亡小体

培养的心肌细胞(2×10^６ cells/mL)用胰蛋白酶消化下来后，用PBS洗涤两次，离心去除细胞碎片。以350目尼龙网过滤去除细胞团块，加入RNase至100 μg/mL，37℃消化30 min，50 μg/mL碘化丙锭(PI)4℃染色1 h，ELITE型流式细胞仪检测，以Multicycle软件分析数据，记录亚二倍体峰(aneuploid peak, AP)，即凋亡小体百分率。

四、LDH活性测定

通过测定培养介质中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)的活性来评价H_２O_２对培养心肌细胞膜的损伤。以不同浓度的H_２O_２作用不同的时间，取培养液在日立7150生化自动分析仪上测LDH活性。每个浓度的实验做6份重复测试。

五、MDA含量测定

通过测定细胞及培养介质中的总丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量来评价H_２O_２对细胞膜中脂质过氧化反应的影响。以1，1，3，3-四甲基丙烷为标准品，岛津RF-540荧光分光光度计测定MDA的含量。

六、以Giemsa染色观察培养心肌细胞形态学的改变按病理学常规方法涂片，在光镜下观察。

七、统计处理

数据以均数±标准差表示，H_２O_２作用前后采用方差分析。

结果

一、DNA-琼脂糖凝胶电泳分析

不同浓度的H_２O_２作用于培养心肌细胞一定的时间后，从中提取DNA进行电泳。结果表明，当5～10 mmol/L H₂O₂作用6 h，染色体核小体间断裂，产生具一定寡核苷酸长度的DNA片段，紫外灯下可见到典型的细胞凋亡DNA梯状带(见图1，第3泳道)。低浓度的H_２O_２(＜1 mmol/L)作用6～24 h，对培养的心肌细胞核均未见有影响，DNA电泳出现高分子量的完整DNA带，无梯形带(见图1，第4泳道)。当高浓度的H_２O_２(＞10 mmol/L)作用于培养心肌细胞2 h，就可造成心肌细胞坏死性死亡，DNA电泳出现典型的弥散(smear)泳带(见图1，第2泳道)。

二、Giemsa染色的细胞形态学分析

形态学分析表明，5～10 mmol/L H_２O_２作用6 h，Giemsa染色的细胞涂片表现出典型的凋亡形态学改变，细胞体积缩小，细胞核及染色质浓聚，呈半圆型或新月型聚集在核膜周边，染色体断裂成碎片并附着在核膜边缘，并有凋亡小体存在(见图2A)。低浓度的H_２O_２(