［摘要］目的：了解抗癌药物顺铂（CDDP）、阿霉素（ADM）诱导肝细胞肝癌 (HCC)的细胞凋亡阈值。方法：采用肿瘤细胞原代培养技术、活细胞萤光染色法和流式细胞仪定量分析。结果：顺铂或阿霉素与细胞共同培养后，荧光显微镜下见正常细胞核呈弥散均匀荧光，凋亡细胞核内颗粒状荧光。随抗癌药物（ADM、CDDP）剂量的增加，诱导人肝癌细胞的细胞凋亡率也增加，但以ADM 1.0μg/mL和2.0μg/mL及CDDP 1.5μg/mL和3.0μg/mL作用明显。ADM 2.0 μg/mL可导致HCC细胞凋亡75%，CDDP 3.0μg/mL 可致HCC细胞凋亡75%。25例未经治疗的HCC细胞和Hep G-2细胞的ADM、CDDP敏感性检测表明，ADM的凋亡阈值为1.0μg/mL，CDDP的凋亡阈值为1.5μg/mL。临床凋亡敏感剂量分别为ADM 20 mg/m²,CDDP 30mg/m² 。结论：本文获得的ADM和CDDP诱导HCC细胞凋亡的临床阈值对临床肿瘤化疗有一定的指导意义。

［中图分类号］R735.7［文献标识码］A

［文章编号］1000-4718(2000)03-0199-04

Study of apoptotic thershold of cis-diamminedichloroplatinum and adriamycin on hepatocellular carcinoma

ZHONG Xue-yun

( Department of Pathology, Medical College of Jinan University, Guangzhou 510632, China)

CHEN Yun-xian

(First Affiliated Hospital, Sun Yat-Sen University of Medical Sciences, Guangzhou)

SUN Xiao-dong

(Affiliated Sir Run Shaw Hospital of Zhejiang University, Hangzhou)

［Abstract］AIM：To study the thershold of hepatocellular carcinoma (HCC) apoptosis induced by adriamycin (ADM) and cis-diamminedichloroplatinum(CDDP).METHODS: Using primary human hepatocellular carcinoma culture, immunofluorescence staining of Hoechst 33 258 in HCC cells ,and flow cytometric assay.RESULTS:24 h after HCC cells were cultured with ADM or CDDP, it were found there were dispersive fluorescences in normal cells nuclei, and compact particulate fluorescences in apoptosis cells nuclei by immunofluorescence staiming of Hoechst 33 258. The rate of HCC cells apoptosis was dependent on doses of ADM and CDDP. HCC cells apoptotic threshold were determined, i.e.ADM was 1.0 μg/mL and CDDP was 1.5μg/mL (The clinical apoptotic sensitive dosages were ADM 20 mg/m² and CDDP 30 mg/m².CONCLUSION: HCC cells apototic threshold of ADM and CDDP were efficient in clinical chemotherapy.

［MeSH］Doxorubicin; Cisplatin; Hepatoma

原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，发病率在恶性肿瘤中居第2位。本病起病隐匿，病情发展迅速，临床诊断时多为中晚期。因此化学药物治疗仍是其重要的治疗手段之一。但是由于患者自身的多药耐药(multidrug resistance, MDR)以及化疗药物的毒副作用，其疗效欠佳。近年来发现许多抗癌药物(如5-Fu、阿霉素、顺铂，长春新碱等)能通过细胞凋亡的途径杀死肿瘤细胞^［1，2］。为了解抗癌药物诱导肝细胞的凋亡阈值，给临床的优化治疗提供实验依据，我们采用原代肝癌细胞培养技术，观察抗癌药物顺铂(cis-diamminedic-

hloroplatinum,CDDP)、阿霉素（adriamycin, ADM）诱导肝癌细胞凋亡的最小剂量(即凋亡阈值)。

材料和方法

一、标本来源

（一）25例肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)标本取自暨南大学第一附属医院和中山医科大学附属肿瘤医院原发性肝细胞肝癌手术病人的手术切除肿瘤组织，术前患者均未经化疗，术后经病理检查证实。

（二）人肝癌细胞株Hep G-2由暨南大学病理教研室提供。

二、实验方法

（一）取材与处理病人的手术标本切下后，立即剪取未坏死的肝癌组织，部分标本置于含青霉素、链霉素的RPMI 1640培养液内，4℃保存，4 h内制备单细胞悬液；部分标本立即冰冻切片（厚度5μm），用免疫细胞化学染色法检测MDR的P-糖蛋白（P-glycoprotein ,P-gp）。

（二）HCC单细胞悬液制备按文献及我们的改良方法制备HCC单细胞悬液^［3～5］。

用眼科剪刀剪除标本的结缔组织，将标本剪成小块，用注射器活柄压碎，加入0.05%的胰蛋白酶，4℃消化6～8 h。当组织块外观呈粘稠状时加入适量的Hanks液，用吸管反复吹打,4层纱布过滤，离心、洗涤后用RPMI 1640培养液重新悬浮成单细胞悬液。

（三）ADM、CDDP诱导HCC细胞凋亡^［4］用含10%胎牛血清的RPMI 1640液将HCC单细胞悬液和Hep G-2细胞株细胞浓度调整至10⁶/mL，两种细胞悬液均分为6组(A、B、C、D、E、F)，37℃、 5%CO₂浓度，二氧化碳培养箱培养。细胞接种24h后加入不同浓度的ADM、CDDP，使ADM的浓度为A组0μg/mL，B组0.125μg/mL，C组0.25μg/mL，D组0.5μg/mL，E组1.0μg / mL ，F组2.0μg/mL；CDDP的终浓度为A组0μg/mL，B组0.1875μg/mL，C组0.375μg/mL，D组0.75μg/mL，E组1.5μg/mL，F组3.0μg/mL。继续培养24h，常规胰酶消化，PBS洗涤1次，调整细胞浓度为10⁶/mL，行活细胞荧光染色和流式细胞仪PI染色，检测细胞凋亡情况。

（四） 活细胞荧光染色法^［5］加Hoechst 33 258 (Sigma 公司产品)入单细胞悬液，终浓度为1μg/mL，避光染色15 min，滴片后在荧光显微镜下观察细胞核DNA荧光。

（五）流式细胞仪碘化丙啶（propidium iodide, PI）染色法^［6］70%乙醇、4℃固定细胞悬液过夜；离心去除上清，细胞重悬在0.4 mL的PBS中，加10μL 5 mg/mL RNase A(Sigma公司产品)，37℃处理1 h；然后加50μL的溴化丙啶染色液(PI,1 mg/mL, Sigma 公司产品) ，4℃染色过夜。流式细胞仪进行细胞周期分析，低于G_１期DNA含量细胞为凋亡细胞。

（六）HCC的P-gp检测冰冻切片的HCC标本稍凉干后，用4%多聚甲醛固定10 min，PBS（pH 7.20）冲洗，0.5% H₂O₂-甲醛浸泡消除内源性过氧化物酶，PBS冲洗后用马血清孵育10min，滴加抗P-gp单克隆抗体，37℃孵育1 h，PBS冲洗，加生物素-亲和素-过氧化物酶复合物（ABC），再次37℃孵育1h，PBS冲洗，DAB显色，光学显微镜下观察500个细胞。胞膜和胞浆出现棕黄色颗粒着色为阳性，未着色为阴性。

三、统计学处理

数据以±s表示，显著性检验用χ²分析。

结果

一、抗癌药物(ADM、CDDP)诱导人肝癌细胞的细胞凋亡结果

(一)活性细胞荧光染色检测结果在荧光显微镜下，正常细胞核呈弥散均匀荧光，凋亡细胞核内见浓度改染的颗粒状荧光(图1)。计算500个细胞的细胞凋亡率。结果表明，随抗癌药物(ADM、CDDP)剂量的增加，肝癌细胞核DNA呈颗粒状染色的比例也增加，但以E组和F组作用明显，结果见图2、3。

（二）流式细胞仪检测结果用流式细胞仪定量检测低于G₁期细胞(凋亡细胞)，DNA直方图上出现二倍体峰减少(G₁细胞)，G₁峰左侧出现亚二倍体细胞群的峰型(亚G₁峰)，而在光散射图谱上，出现低于正常的前向散射和较高的侧射。结果表明，ADM（2.0μg/mL）和CDDP（3.0μg/mL）可致HCC细胞亚二倍细胞群高达75%，见图4。

Fig 1 Immunoflourescence staining of Hoechst 33258 24 h after ADM administered in HCC cells(×500)

→:dispersive fluorescences in normal cells nuclei

△:compact particulate fluorescences in apoptosis cell nuclei

1ADM作用HCC细胞24 h后，Hoechst 33258染色

Fig 2 Comparison of different doses of ADM on numbers of

HCC cell apotosis (±s,n=6)

2不同剂量ADM诱导HCC细胞凋亡的比较

Fig 3 Comparison of different doses of