［摘要］目的：构建噬菌体表面表达随机8肽文库；方法：采用人工合成随机寡核苷酸、基因重组技术，噬菌体表面表达技术等，构建该文库；采用多聚酶链式反应技术、核酸杂交技术和测序分析评价鉴定。多聚酶链式反应所采用的上游引物包括载体克隆位点处部分碱基和部分外源基因的碱基；在核酸杂交中设计了噬菌体载体克隆位点互补探针,以更加准确地排除无外源基因插入的克隆；在测序鉴定中，选择了2个混合探针杂交阳性的克隆。结果：以上证实获得独特克隆为2.1×10⁸；亲和富集实验证实所建噬菌体文库可以稳定扩展。结论：我们成功地构建了噬菌体随机8肽文库,其库容量为2.1×10⁸。

［中图分类号］ Q782；Q343［文献标识码］ A

［文章编号］1000-4718(2000)03-0243-04

Construction of phage random eight-peptide library

LIU Ge-xiu，WANG Hua, ZHANG Tong, Huang Hong-lin, LIAO Duan-fang

( Department of Pharmacology, Hengyang Medical College, Hengyang 421001, China)

［Abstract］ AIM: To construct random eight-peptide library for the study on atherosclerosis and restenosis. METHODS andRESULTS: Random oligodeoxynucleotides encoded eight peptides were synthesized and amplified by polymerase chain reaction(PCR). The product was cloned into phage surface display vector fUSE5 in Sfi I site and electroporated into competent MC1061. The library was identified through PCR, hybridization, DNA sequencing and affinity biopanning of streptavidin. Because the upstream primer is complementary to part vector clone site sequences and part exogenous gene sequences, and the other one complementary to pIII gene of vector, thus only clones inserted exogenous gene could be amplified easily. Additionally we used the probe oligodeoxynucleotide complementary to vector clone site sequences to identify clones which were not inserted exogeneous genes. Furthermore, two hybridizing positive clones were sequenced. Their sequences are consistent with two oligodeoxynucleotide probe sequences. As a result, 2.1×10⁸ special clones were obtained. Affinity biopanning proved that the libraries could be amplified steadily.CONCLUSION: The eight-peptide library is reliable.

［MeSH］ Phages; Peptides

噬菌体表面表达技术(phage display techniques, PDT)^［1］是以改建的噬菌体为载体，把外源基因插入噬菌体外壳蛋白质基因，以使表达的外源肽或蛋白质显露在噬菌体的表面，并保持其空间构象，通过亲和免疫吸附法筛选出特异表达肽或蛋白质的新技术。目前国外成功地构建了不同大小的肽文库、抗体文库、蛋白质文库，并筛选出了比现有活性物质功能更好的新型分子^［2～4］。结合该技术开展心血管疾病药物筛选研究仍处于起步阶段，但是其应用前景令人关注:特异结合抗纤溶酶原激活物抑制剂^［5］,组织纤溶酶原激活剂和尿激酶型纤溶酶原激活剂抑制物的筛选^［6］, 血小板膜受体的拮抗剂的筛选^［7］，抑制血小板凝聚的短肽^［8］的研究。上述这些研究其潜在的药物开发价值是显而易见的。而国内目前无这方面的报道。本文构建噬菌体8肽随机文库旨在为今后开展动脉粥样硬化和再狭窄研究，特别是其标志物和治疗药物的筛选研究打下基础。

材料和方法

一、菌株和载体

K 91、MC1061受体菌和噬菌体载体fUSE 5由中国预防医学科学院病毒研究所张英博士和李爱民博士惠赠。

二、酶和试剂

非放射性寡核苷酸3标记试剂盒为Boehringer Mannheim公司产品。限制性内切酶、T4 DNA连接酶、琼脂糖为Promega公司产品，多聚酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)试剂为上海生物工程公司产品，氯仿、乙醇等均为国产分析纯产品，DNA序列分析试剂盒为美国应用生物系统公司产品。

三、DNA合成与纯化

含编码8肽DNA序列为5CATTCTCACTCGGCC

GACGGGGCT(NNK)₈GGGGCCGCTGGGGCCGAAACTGTTGAA 3，其中N代表A、T、C、G四种碱基，K代表G、T两种碱基，(NNK)₈为编码随机8肽部分，划线部分为BglI识别序列。用于扩增8肽随机DNA片段引物：P₈₁5CTATTCTCACTCGGCCGACG 3和P₈₂5GACCCCGGCTTTGACAACTT 3；测序引物5 TGAATTTTCTGTATGAGG 3, 鉴定引物P₈₃包括载体克隆位点处部分碱基和部分外源基因的碱基(带有*标记的碱基)：5CTATTCTCACTCGGCCGACGG* 3；下游引物P₈₄：5GATGATACAGGAGTGTACTGGTAA

3’，对应载体pⅢ基因。均为上海生物工程公司产品(HPLC纯)。

四、感受态菌的制备

取新鲜复活K91、MC1061菌1 mL接种于含链霉素(100μg/mL)的LB培养基250 mL，剧摇3 h，低温低速离心，等体积冰预冷的HEPES液洗涤菌体2次，再用10 mL预冷的10%甘油洗1次，最后用500μL 10%甘油悬浮菌体，分装后置-70℃保存备用。

五、PCR扩增及文库构建^［4］

每100μL PCR反应液含1.5 mol/L MgCl₂、50μmol/L dNTP、1单位Taq酶、引物各2.5 pmol；扩增反应进行5个循环：95℃ 1.5 min、55℃ 2 min、72℃ 1 min。纯化扩增产物、BglⅠ酶切后，插入fUSE5的SfiI位点，电转化MC 1061菌。转化混合物直接铺含四环素(20 μg/mL)和链霉素(100μg/mL)平板，明确转化克隆数量。在相同条件下，把电转化混合物先在含1.0 μg/mL四环素的LB液体中扩增1 h后，再使四环素的浓度升至20 μg/mL继续扩增12～16 h，提取噬菌体，即噬菌体8肽原库。

六、寡核苷酸DNA探针的末端标记与核酸杂交

11种寡核苷酸DNA片段(见表1)，其中P-mcs为与fUSE5载体克隆位点互补的片段。由上海生物工程公司合成。菌落影印原位杂交实验操作见《分子克隆实验指南》（金冬雁译，科学技术出版社，第2版）和Boehringer Mannheim公司试剂盒所附操作规程进行。

七、DNA序列分析

按美国应用生物系统公司Tag测序试剂盒说明书在373A DNA自动序列测序仪上测序。

八、转染单位的测定和亲和素富集筛选

即为每毫升噬菌体感染宿主菌形成的具有侵染能力的菌落单位。对8肽扩增库做连续10倍稀释后加顶层琼脂，迅速直接铺(20 μg/mL)四环素平板，培养16 h，计数形成的菌落。亲和素富集是以亲和素包被聚苯乙烯板，加扩增的8肽库作用3 h，用TBS缓冲液洗板10次，每次2 min，再用洗脱液(pH 2.2,甘氨酸－盐酸液)洗下结合物，用1 mol/L Tris-HCl(pH 9.1)恢复洗脱物pH为7.0，再行扩增。如此反复进行3轮，每轮用亲和素筛选8肽库前后均测定转染单位，以评定亲和素富集肽库的效率。

结果

一、噬菌体随机8肽文库的构建及鉴定

(一)PCR鉴定随机挑取18个噬菌体单克隆，提取载体DNA为扩增模板，采用PCR对不同的样品进行扩增。扩增产物经电泳分析，均见到预计大小的扩增片段533 bp(见图1)。此结果证实获得的噬菌体克隆中已插入编码8肽的DNA片段。

(二)杂交鉴定如表1所示，采用3′末端标记，将fUSE5载体克隆位点互补P-mcs探针和10种寡核苷酸混合探针分别与构建的噬菌体8肽文库杂交。结果混合探针与噬菌体8肽原库和不同批次扩增肽文库抽提的DNA均发生特异性杂交，而与设立的fUSE5载体没有发生杂交，P-mcs探针与噬菌体8肽原库和不同批次扩增肽文库抽提的DNA极少发生特异性杂交，而与设立的fUSE5载体发生特异杂交。

(三)测序鉴定提取2个混合探针杂交阳性的克隆和10个随机克隆单链DNA，测序，结果混合探针杂交阳性的2个克隆的序列与2条寡核苷酸探针序列一致：8 PDT-117与探针probe 3互补，8 PDT-937与probe 9互补。随机克隆的序列相互不同且与前2个序列也不同，插入片段读框正确(见表2)。

Fig 1Random eight-peptide library identified by PCR

Lane 1：Amplification of fUSE5 vector DNA using primer P81 and P84

Lane 2：Amplification of fUSE5 vector DNA using primer P83 and P84

Lane 3～21：PCR amplification of single clones using P83 and P84

M.pGEM-7Zf(+)/Hae Ⅲ DNA marker

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